心率和寿命有着直接性的关系 http://www.zgbdf.net/baidianfeng/baidianfengjishu/56780.shtmlB淋巴细胞抗原19（ClusterofDifferentiation19，CD19）是特异性表达于B淋巴细胞的免疫球蛋白超家族成员，分子量为95kDa，包含两个Ig样C2型（Ig-likeC2）结构域，是B细胞抗原受体（BCellAntigenReceptor，BCR）信号转导的关键辅助受体。CD19与BCR的联合能够协同增强钙释放、丝裂原激活蛋白激酶活性和细胞增殖[1]。一方面，CD19与BCR的联合能够协同增强钙释放、丝裂原激活蛋白激酶活性和细胞增殖；另一方面，将CD19连接到远离BCR复合物的位置会抑制BCR的信号转导，发挥负向调节作用[1]。因此，CD19和许多其他信号分子一样，是一把双刃剑，它的异常表达与自身免疫性疾病的发生密切相关。CD19的异常表达能引起多种疾病，视神经脊髓炎谱系疾病（NeuromyelitisOpticaspectrumDisorders，NMOSD）就是其中的一种，NMOSD是一种罕见的、严重的、复发性的自身免疫性炎性中枢神经系统疾病，主要影响脊髓和视神经并造成严重损害。该病可引发严重的肌无力、瘫痪、失明、呼吸衰竭、肠和膀胱功能问题及视神经性疼痛。流行病学资料显示，NMOSD的患病率约为十万分之五，且女性多于男性，年5月被纳入国家种罕见病目录[2]。研究表明，约80%的NMOSD患者体内会产生针对水通道蛋白（Aquaporin-4，AQP4）的抗体，这些抗体由CD19+B细胞产生，主要与中枢神经系统的星形胶质细胞结合而引发攻击机体的免疫反应。目前尚未有针对NMOSD的预防和治疗性药物。靶向CD19的单抗能以高亲和力靶向结合B细胞表面的CD19蛋白，并耗竭产生这些抗体的细胞，从而发挥治疗作用。已经批准上市的靶向CD19的抗体类药物有Inebilizumab、Tafasitamab[3]单抗，Blinatumomab双特异性抗体以及抗体偶联药物Loncastuximabtesirine，其中Inebilizumab的适应症为神经脊髓炎谱系障碍[4-5]，Tafasitamab和Loncastuximabtesirine的适应症为复发、难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤，Blinatumomab适应症为急性淋巴细胞白血病。此外，国内外亦有诸多企业开展抗CD19单抗的临床及临床前研究。为了有效地对抗CD19的单抗进行质量控制，保证其安全性和有效性，本文以抗CD19的单抗为研究对象，依据现行版《中华人民共和国药典》和人用药品注册技术要求国际协调会议（TheInternationalCouncilforHarmonisationofTechnicalRequirementsforPharmaceuticalsforHumanUse，ICH）的指导要求，研究建立肽图、还原/非还原CE-SDS、SEC-HPLC、iCIEF、生物学活性等方法，针对产品的关键质量属性进行分析和探讨，为抗CD19单抗的质量控制提供依据和指导。1材料与方法1.1样品重组人源化、Fc段经去岩藻糖化改造的抗CD19的单抗参比品及样品均为本实验室留样。1.2细胞人B淋巴母细胞Daudi购自ATCC，工程化的可过表达高亲和力FcγRIIIa-V受体并经NFAT-荧光素酶报告基因转染的人自然杀伤细胞NK-92（CD16-NFAT-luc-NK92）由本室冻存、传代。1.3试剂材料二硫苏糖醇（DTT）、8.0M盐酸胍购自ThermoScientific；碘乙酰胺（IAM）购自Biosciences；载体两性电解质PharmalyteTM3-10及8-10.5购自GEHealthcare公司；pI标志物5.85及9.22、1%甲基纤维素溶液、0.5%甲基纤维素溶液、cIEF柱FC-涂层均购自ProteinSimple公司；色谱级甲酸、色谱级乙腈购自ThermoFisher公司；三氟乙酸（TFA）、乙二胺四乙酸四钠盐水合物（EDTA）、2-甲基吡啶硼烷、2-氨基苯甲酰胺、甲酸铵、遗传霉素、2-巯基乙醇、N-乙基马来酰亚胺（NEM）、一水合磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、无水硫酸钠及5%叠氮化钠溶液均购自sigma公司；谷氨酰胺、胎牛血清、马血清、细胞培养基RPMI购自Gibco公司；肽-N-糖苷酶F（PNGaseF）、质谱级胰蛋白酶、Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。毛细管50μm×31cm购自Beckmancoulter公司，TSKGSWXL，7.8mm×30cm色谱柱购自东曹公司；ACQUITYUPLCpeptideCSHC18（2.1×mm，1.7μm）及AcquityUPLCGlycoproteinBEHAmideA，1.7μm,2.1×50mm购自Waters公司。1.4主要仪器高效液相色谱仪配有紫外检测器及Empower数据处理系统（Waters公司）；超高效液相色谱仪配备紫外检测器、荧光检测器和Empower数据处理系统（Waters公司）；PAplus系统配备PDA检测器（BeckmanCoulter公司）；毛细管等电成像仪iCE3（ProteinSimple公司）；SPECTRAM5酶标仪（Moleculardevice公司）。1.5生物学活性测定因为该抗体Fc段通过去岩藻糖化的改造，因此其主要作用机制是通过抗体依赖性细胞毒作用（AntibodyDependentCellularCytotoxicity，ADCC）来杀伤B细胞，基于体内作用机制，本研究使用转基因细胞法通过检测抗CD19单抗的抗体依赖的细胞毒性（AntibodyDependentCellmediatedCytotoxicity，ADCC）作用来反映其生物学活性。抗CD19抗体的Fab(AntigenBindingFragment，Fab)可与Daudi细胞表面的CD19结合，Fc（CrystallineFragment，Fc）与带有荧光素酶标记的NK-92转基因细胞表面的FcγRIIIa相互作用，从而诱导ADCC活性，通过测定荧光素酶的信号值，即可反映抗CD19的生物学活性，原理如图1所示。Daudi细胞复苏后于含10%胎牛血清的RPMI培养基中37℃、5%CO2培养，维持细胞密度不大于0.8×个活细胞·mL-1，且活力不低于90%。NK-92复苏后于测试培养基（含mL谷氨酰胺的RPMI、mL胎牛血清、mL马血清、10mL遗传霉素和1.8mL2-巯基乙醇）中37℃、5%CO2培养，维持细胞密度不大于（0.4~1.2）×个活细胞·mL-1，且活力不低于90%。将抗CD19抗体以2μg·mL-1为起始点，用测试培养基按1:3.5进行倍比稀释后，以每孔50μL加入各孔，每个浓度点设置2个复孔。收集悬浮生长的Daudi细胞和NK-92细胞，分别调整密度为2.0×个活细胞·mL-1，将二者混匀，以每孔50μL加入到检测板中。之后将96孔板于37℃、5%CO2孵箱中孵育6h，之后每孔添加μL发光底物，并在SPECTRAM5酶标仪上采用化学发光模式进行读数。该方法的系统适用性要求为标准曲线R2≥0.；样品与参比品的斜率比在0.70~1.30范围内。1.6纯度分析1.6.1CE-SDS使用还原/非还原CE-SDS法进行分析，用超纯水将样品稀释至10mg·mL-1，取该溶液10μL，加入SDS样品缓冲液75μL，另外，还原CE-SDS法加入巯基乙醇5μL，非还原CD-SDS法加入0.1mol·L-1N-乙基马来酰亚胺5μL，混匀，之后在72℃水浴条件下孵育8min，室温放置5min，涡旋混匀并离心之后取90μL置于进样瓶中后上机分析。使用BeckmanPAplus毛细管电泳系统，无涂层毛细管（内径50μm，总长度31cm，有效长度21cm）检测。检测条件：进样电压为5.0kV，分离电压为15kV，毛细管温度为25℃，样品室温度为15℃，紫外检测波长为nm。计算样品轻链峰+重链峰（还原型）或主峰（非还原型）峰面积百分比以及片段峰面积百分比。还原CE-SDS的系统适用性要求：两针参比品重链迁移时间差≤1.0min；非还原CE-SDS系统适用性要求：两针参比品主峰迁移时间差≤1.0min。1.6.2SEC-HPLC使用SEC-HPLC进行分析，将样品用流动相稀释至10mg·mL-1，采用Waterse高效液相色谱系统配备紫外检测器、TSKGSWXL，7.8mm×30cm色谱柱进行检测。流动相由0.1M磷酸钠和0.1M硫酸钠配制而成，pH为6.8，流速为1.0mL·min-1，上样量25μL，进样器温度5℃，柱温25℃，在波长nm处检测，使用面积归一化法计算单体和聚合物的百分比。该方法系统适用性要求为参比品主峰的拖尾因子在1.1~1.2范围内；理论塔板数≥。1.7电荷异质性使用成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）法进行分析，将样品用超纯水稀释至5mg·mL-1，并置换缓冲液至超纯水中。取μL超纯水、μL1%甲基纤维素、50μLPharmalytes5-8、50μLPharmalytes3-10、12.5μLpImarker5.85，以及12.5μLpImarker9.22配置预混液，然后取5μL样品与μL的预混液混合上样进行检测。分析条件：预聚焦电压1.5kV，持续1min；聚焦电压3kV，持续时间为10min。该方法系统适用性要求：主峰pI介于8.1~8.3之间。1.8鉴别试验使用肽图进行鉴别分析，取约0.5mg的单抗样品（以单抗的蛋白含量计算），加入0.5mol·L-1二硫苏糖醇5μL和变性缓冲液（由8M盐酸胍、mMTris和1mMEDTA配制而成，pH为7.6）μL，混匀后放置于37℃水浴孵育30min，结束后加入0.5M碘乙酰胺12μL，再室温条件下避光孵育30min，之后取20μL样品加入μL的酶切缓冲液（mMTris，pH7.6）和6μL胰蛋白酶储备液（2mg·mL-1），在37℃水浴中酶切4h，之后加入6.3μL的5%TFA终止反应。使用超高效液相色谱系统，紫外检测器，ACQUITYUPLCpeptideCSHC18（2.1×mm，1.7μm）色谱柱进行样品的分离，在波长nm处检测。液相色谱条件：流动相A为0.02%的三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.02%的三氟乙酸-乙腈溶液，采用梯度洗脱（0~78.5min，流动相B从5%上升至95%；78.5~80min，流动相B从95%降低至5%），流速为0.2mL·min-1，上样量为26μL，样品室温度为5℃，柱温为55℃。该方法系统适用性要求为参比品特征肽段L4的保留时间介于0.9~1.1之间。1.9寡糖含量分析使用超高效液相色谱法进行分析，将样品用50mMTris缓冲液（pH7.8）稀释至5mg·mL-1，取20μL样品，加入10μL20%的PNGaseF，PNGaseF需先用50mMTris缓冲液（pH7.8）进行预稀释，37℃水浴18h进行消化。加入30μL2-AB标记溶液（mg2-氨基苯甲酰胺，μL乙腈，μL甲酸），37℃孵育30min进行标记。然后加入μL乙腈再使用PolySULFOETHYL离心柱进行纯化，纯化产物上样分析。色谱条件：流动相A为50mM甲酸铵，pH4.4；流动相B为乙腈；使用WatersH-Class超高效液相色谱仪，荧光检测器进行分析，检测器激发波长nm，发射波长nm，色谱柱为AcquityUPLCGlycoproteinBEHAmideA，1.7μm,2.1×50mm；进样体积为5μL，柱温60℃，样品盘温度10℃。采用面积归一化计算高甘露糖型的含量。该方法系统适用性要求：序列中多针（至少3针）参比品G0峰面积的RSD≤5%；保留时间的RSD≤2%。2结果2.1生物学活性以抗CD19抗体浓度的对数值为横坐标，荧光素酶的信号值为纵坐标，构建的四参数曲线如图2所示，计算生物学活性的半数最大效应浓度（EC50），6次试验测定的EC50值为（10.09±1.40）ng·mL-1，RSD为13.88%。2.2纯度2.2.1还原/非还原型CE-SDS还原CE-SDS典型图谱如图3A所示，经过6次试验测定，轻链与重链峰面积之和百分比为（98.77±0.05）%，RSD为0.05%。非还原CE-SDS典型图谱如图3B所示，测定结果：主峰峰面积百分比为（96.19±0.05）%，RSD为0.05%；片段百分比为（3.81±0.05）%，RSD为1.31%。2.2.2SEC-HPLCSEC-HPLC的典型图谱如图4所示，系统适用性要求主峰拖尾因子在1.1~1.2范围，理论塔板数≥，均符合要求，经过6次试验测定，SECHPLC单体的峰面积百分比为（99.42±0.）%，RSD为0.%；聚合物峰面积百分比为（0.54±0.）%，RSD为0.05%。2.3成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）iCIEF分析结果的典型图谱如图5所示，系统适用性要求主峰pI介于8.1~8.3之间为符合要求。6次试验测定的主要亚型的峰面积百分比为（66.41±0.38）%，RSD为0.57%；酸性亚型的峰面积百分比为（13.69±0.16）%，RSD为1.17%；碱性亚型的峰面积百分比为（19.90±0.46）%，RSD为2.31%。2.4肽图肽图的鉴别的典型图谱如图6所示，样品图谱与参比标准品图谱目视具有可比性，鉴别并确认L4肽，其相对保留时间比（参比品与样品之间）必须在0.9至1.1之间，检测样品的所有5个标志性肽H5、H4、L1、H2和L4与参比品图谱一致。2.5糖基化分析糖基化分析的典型图谱如图7所示，糖型的命名见谱图，占比最高的3个糖型分别为G0、G0-GN和M5，经6次试验测定G0的含量为（64.64±0.61）%，RSD为4.29%；G0-GN的含量为（9.75±0.42）%，RSD为3.52%；M5含量为（6.22±0.35）%，RSD为8.92%。3讨论近年来，单抗类药物的开发进入到了黄金时期，尤其是用于治疗肿瘤和免疫系统疾病的单抗药物飞速发展，在美国FDA(FoodandDrugAdministration）批准的新药中，单抗类药物的占比逐年增加。我国的单抗药物的市场还处于初级发展阶段，一些在欧美批准上市的单抗药物暂未在我国获批，但是随着审评审批的加快，越来越多靶点的单抗药物进入到国内。CD19作为近年来
