“/09/21”
今天推送的文章来自于年8月发表在MicrobialCellFactories的“ImprovingcitricacidproductionofanindustrialAspergillusnigerCGMCC:identifcationandoverexpressionofahigh-afnityglucosetransporterwithdiferentpromoters”。通讯作者为天津科技大学生物技术学院的DepeiWang。
“1”
低亲和力葡萄糖转运蛋白是在相对较高的葡萄糖浓度(50g/L)的发酵过程中将葡萄糖输入细胞的限制因素。相比之下，当糖浓度极低时，高亲和力葡萄糖转运蛋白甚至可以在发酵结束时发挥作用，如图1所示。
图1葡萄糖-柠檬酸转化途径的方案包括LGT和HGT1如何转运葡萄糖
“2”
通过计算由于产酸和菌落直径而产生的透明晕圈的比率来筛选68个阳性转化体。选择8个优级转化株（黑曲霉20-15、20-16、20-25、20-27、20-29、21-8、21-28、21-32）进行摇瓶发酵筛选高产转化体（图2A）。转化子20-15和21-8在低糖（低于1%）真菌完全培养基（CM）平板下的生长速度比亲本快，可以证实HGT1可以促进葡萄糖的吸收从而加速应变的增长。
图2通过摇瓶发酵和环直径比验证转化子的柠檬酸产量
“3”
在不同的时间菌丝球的CA发酵期间的形态示于图3A。亲本的形态的黑曲霉菌株CGMCC，以及转化黑曲霉20-15和21-8，正常在每个采样时间。24h前菌丝球直径迅速增大，表明菌株已进入快速生长期。24h后菌团略有增加，菌落开始萌发小菌丝体，开始进入CA生产期。由于在液体发酵中没有产生新的孢子，所有菌株在发酵32小时后具有相似的生物量。证实了HGT1的过表达促进了发酵后期碳源接近枯竭时CA的产生。
图L生物反应器发酵菌丝形态观察及柠檬酸产率验证
“4”
HGT1的相对表达显示于图4A的转录水平HGT1在过表达菌株比在12和48小时的控制高得多。PglaA是一种广泛使用的强真菌启动子，可由淀粉或葡萄糖诱导，而Paox1是黑曲霉中替代氧化酶的天然启动子。值得注意的是，在过表达HGT1菌株葡萄糖激酶的相对表达水平比亲本菌株高，尤其是在48小时（图4B）。如图所示4C，柠檬酸合成的（CS）的表达呈现类似的趋势，以葡糖激酶在48小时时，工程化黑曲霉菌株20-15的CS表达比亲本菌株高6.4倍。
图4黑曲霉20-15、21-8和菌株中HGT1、葡萄糖激酶和柠檬酸合酶在12和48小时的表达谱的实时qPCR分析
“
综上所述，在这项研究中，作者研究了过表达葡萄糖转运蛋白HGT1对工业CA发酵的影响，发现它有利于在摇瓶和30L实验室规模生物反应器中生产CA。CA产量的增加可以通过增加糖利用率和对关键代谢基因表达的间接积极影响来解释。葡萄糖转运蛋白基因的过度表达可用于降低工业规模生产的成本并提高柠檬酸的产量。
文章链接:
