大家好，今天分享的文章是“AnefficienttoolformetabolicpathwayconstructionandgeneintegrationforAspergillusniger”。该文在年5月发表于BioresourceTechnology，作者是ParveenSarkari等人。
引言
代谢工程是一种常用于提高微生物代谢能力以生产多种化工产品的技术。尽管丝状真菌的生产能力很有前景，但基因工程工具的应用却落后于其他微生物，如大肠杆菌或酿酒酵母。然而，使用非同源末端连接已经取得了一些重大的改进，最近CRISPR/Cas9系统也被证明在丝状真菌中具有功能，从而加快了其开发。
成果简介
1、以黑曲霉为例，提出了一个DNA构建和整合系统，该系统将多种功能整合为一个高效的代谢途径构建和基因组整合系统，易于应用于其他宿主生物。该系统基于金门克隆方法，称为Goldenmocs，代表金门衍生的多生物克隆系统。
2、为了整合真菌基因，使用了一种合适的CRISPR/Cas9系统，利用了瞬时表达策略。对pyrG基因座应用分裂标记策略可以对整合事件进行直接选择，这大大减少了筛选整合转化子的工作。
图文解读
图1：金门衍生克隆系统的分级克隆方案。
该设计的骨架包括三个主要的结构水平和各自的质粒。(A)描述了具有卡那霉素抗性标记和大肠杆菌高拷贝复制源的BB1，包含启动子、编码序列、PCR或DNA合成的终止子等功能元件。(B)受体载体BB2，称为BB2连接子，用于大肠杆菌BB1分子与氨苄西林抗性标记的组装和高拷贝复制源的复制。各自的融合位点(A和B)决定了表达盒在最终目的质粒BB3中的位置。(C)与BpiI(BbsI)和T4连接酶的金门反应导致含有一个完整表达盒的(D)BB2的形成。(E)描述了BB3的接收向量，称为BB3链接器。作为增加克隆灵活性的一个特殊特性，这个BB3连接子可以从具有融合位点FS1的BB1结构体组装到FS4。通常，它们具有在大肠杆菌或相应宿主细胞中起作用的抗性标记(R*)、大肠杆菌的高拷贝复制起点和所需的黑曲霉宿主的复制/基因组整合序列起点。在BB1和BB2之间切换卡那霉素和氨苄西林抗性标记，提高组装效率。在BB3构建的耐药盒(R*)可以自由选择，但优先不是氨苄西林耐药。(F)与BsaI和T4连接酶结合三种不同的表达盒到最终载体(G)的金门反应，用于转化靶宿主细胞，如黑曲霉。限制点上方的黑色小箭头表示切割方向。
图2：缩短AMA1对转化效率和质粒稳定性的影响。
AMA1中的反向重复序列以黑色箭头表示，而唯一的中心间隔（UCS）序列以方形表示。每个AMA1片段包含gusA报告子盒、潮霉素抗性盒、氨苄西林抗性盒和大肠杆菌复制来源的同一质粒主链。通过在有和没有选择压力（潮霉素）的平板上分别放置确定的和稀释的分生孢子悬液，并计算两种条件下的菌落数量，以确定分生孢子中的质粒保留率。选择压力下生长细胞的比例以百分数表示。ND代表未确定。
图3：黑曲霉基因整合系统。
(A)尿嘧啶营养缺陷型菌株（pyrGm1）的产生。将含有pyrG1位点gRNA序列的Cas9瞬时表达质粒转入亲本菌株黑曲霉ATCC。Cas9在pyrG1位点产生双链断裂（橙色框），由宿主细胞的非同源末端连接修复，产生插入/缺失突变（INDELs）。(B)在pyrG位点整合基因片段并恢复原养型。含有目的表达盒的整合质粒与含有gRNA的Cas9质粒共转化，用于pyrG基因的第二个位点即pyrG2（蓝色框）。Cas9对基因组DNA和质粒进行裂解，释放线性整合盒。
图4：含mttA表达盒的黑曲霉菌株（mttA_1、mttA_2）在葡萄糖培养基上生长时分泌有机酸。
在诱导条件下（10μg/ml强力霉素；mttA_1、mttA_2；框形和菱形，黑线）或非诱导条件下（mttA_1、mttA_2；圆形和三角形，灰色虚线）培养菌株。(A)葡萄糖消耗；(B)乌头酸形成，乌头酸值为上清液中检测到的顺式乌头酸和反式乌头酸的累积浓度；(C)柠檬酸形成。上清液中测定的所有浓度均以[g/L]表示。小时后，菌株在诱导条件下达到细胞干重27.2±3.6g/L，在未诱导条件下为41.9±3.5g/L。
总结和展望
1、提出了一种用于黑曲霉的基因工程工具箱，它有助于在一个确定的遗传位点上产生携带异源表达盒的菌株。该系统与金门克隆兼容，方便了DNA构建过程，提供了较高的设计灵活性。
2、设计了一个名为GoldenMOCS的DNA克隆途径，可以快速灵活地构建代谢途径变异。基本的遗传元件（启动子、CDSs和终止子）可以很容易地交换，从而被用于不同的表达宿主。
3、利用CRISPR/Cas9生成一个营养缺陷受体株，随后促进整合事件。Cas9的瞬时表达是必要的，携带的质粒使用缩小的AMA1变体很容易丢失，可实现高达%的真菌基因组高整合效率，从而显著减少筛选过程。该方法的可行性通过整合一个表达盒得以在黑曲霉中生产乌头酸而得到证实。
文献链接
