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黑曲霉酸性果胶裂解酶在大肠杆菌中的表达和酶学性质研究
作者：
张海云1,2，马佳宁3，李阳阳1,2，阳鹏辉1,2，宋伟艳1,2，刘松1*
单位：
1．江南大学未来食品科学中心
2．江南大学生物工程学院
3．大连理工大学化工学院
基金项目：
国家重点研发计划项目（YFA）
摘要关键词
摘要：酸性果胶裂解酶能以β-反式消去作用断裂果胶中的α-1,4糖苷键形成不饱和寡聚半乳糖醛酸，对食品等工业中高酯化果胶降解具有重要意义。该研究将黑曲霉AspergillusnigerAG11来源的酸性果胶裂解酶（pelA）在大肠杆菌Escherichiacoli,BL21(DE3)中进行表达，并进行了蛋白标签优化和酶学性质研究。最终确定在N-端融合碳水化合物结合结构域（carbohydrate-bindingstructuraldomain,CBM）时，pelA的胞内酶活力最高，达到3.25U/mL，比初始条件下提高4.12倍。对CBM切除前后pelA的酶学性质进行测定。结果表明pelA的比酶活力、最适反应温度及最适反应pH分别为15.45U/mg、40℃和5.0。pelA在30~50℃孵育2h保持80%以上活性，这与pelA+CBM相同。在40℃、pH为4.0~5.0时孵育2h，相对酶活力保持在60%以上，此时pelA+CBM具有80%以上的活性。以柑橘果胶为底物，pelA的Km和kcat分别为4.44mmol/L和31.44s-1。该研究结果为pelA的分子改造和在工业生产中的应用奠定了基础。
关键词：黑曲霉；酸性果胶裂解酶；胞内表达；蛋白标签优化；酶学性质
主要结论
为促进pelA在E.coli中的可溶性表达，分别在N-端融合木聚糖酶碳水化合物结合模块（CBM）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、大肠杆菌硫氧还原蛋白（TrxA）、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）等蛋白标签。其中，融合酶CBM-pelA表达后可溶性明显提高，胞内pelA活性达到3.25U/mL，较野生型pelA酶活力提高4.12倍。
a-重组蛋白标签优化菌株表达载体构建；b-重组蛋白标签优化菌株军裂解液上清液酶活力
图1pelA融合蛋白标签的表达
Fig.1ExpressionofpelAfusionproteintag
分别对野生型pelA和CBM-pelA进行纯化，并以柑橘果胶为底物测定其酶学性质和酶促反应动力学参数。结果显示，CBM-pelA的比酶活力较pelA提高了29%，达到15.82U/mg；前者的最适反应温度为50℃，后者的为40℃。值得注意的是，CBM-pelA最适反应pH为6.0，较pelA高1个单位；在pH5.7，CBM-pelA热处理（60℃孵育2h）后保持80.25%活性，而pelA仅有47.59%。在40℃时，CBM-pelA酸处理（pH4.0孵育2h）后保持84.9%活性，而pelA仅有62.87%。与pelA相比，CBM-pelA具有更低的Km（2.68mmol/L）和更高的kcat（37.07s-1）。
图2温度和pH对蛋白标签切除前后重组pelA活性的影响
Fig.2EffectsoftemperatureandpHonpelAactivitybeforeandafterresectionofthemelt-promotingtag
本研究在E.coli中实现了A.nigerAG11来源的pelA蛋白的可溶性表达，并通过N-端融合蛋白标签的方式提高其溶解度，构建pelA的分子改造平台。该研究结果为pelA的分子改造和在工业生产中的应用奠定了基础。
团队介绍
通信作者
刘松，江南大学未来食品科学中心研究员，硕士生导师。从事工业酶分子改造和食品级微生物（链霉菌、曲霉等）表达系统的开发。近年来在BiotechnologyAdvances、ACSSyntheticBiology、JournalofAgriculturalandFoodChemistry及BioresourceTechnology等生物工程类SCI期刊上发表研究论文40余篇，出版英文专著1部（副主编）；授权发明专利40余项，其中国际专利4项；主持国家自然科学基金（面上项目2项、青年基金项目1项）、江苏省自然科学基金、国家重点研发计划子课题、子课题等纵向科研项目及10余项横向课题；获得中国轻工业联合会科学技术进步奖一等奖（，3/9），中国商业联合会科学技术奖一等奖（，4/6）和特等奖（，6/13）。年8月，任中国食品科学技术学会酶制剂分会理事。
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