纤维素生物质是一种丰富的可再生资源，但其通常被填埋或焚烧。通过纤维素预处理、纤维素酶水解、糖发酵、蒸馏纯化等步骤生产以非粮食为原料的生物乙醇。生产及使用以纤维素生物质为原料的第二代生物燃料乙醇，不仅可以实现废物利用、带来新经济增长，而且可以降低碳排放、保护环境。
纤维素酶是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。纤维素酶不是单体酶，而是具有协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。
纤维素酶目前被广泛用于纺织、造纸、食品、饲料等行业，是工业酶中的重要类别。纤维素酶是继淀粉酶（约占25%）和蛋白酶（约占18%）后，全球市场第三大工业酶（约占15%）。纤维素生物质的酶促水解是一种具有潜力的糖的生成方法，产物可以作为多种增值产品（如生物乙醇、有机酸、抗生素和动物饲料）的原料。纤维素的酶促水解优于酸性和碱性水解，因为酶是可回收的，能量需求低且无污染。细菌、真菌和放线菌都可以产生纤维素酶，生产成本和纤维素酶产量是该工艺经济性的主要制约因素。
1 纤维素酶生产技术
纤维素酶生产需要有适当的生产方法和培养条件才能得到较高的酶产量。目前，纤维素酶发酵方式主要有液体深层发酵（SmF）、固态发酵（SSF）等。尽管使用固态发酵生产纤维素酶在工业化生产及成本控制上有优势，但由于生产规模、工艺参数控制等瓶颈制约，目前纤维素酶的商业化生产多在SmF条件下进行。
1.1 纤维素酶液体深层发酵
纤维素酶液体深层发酵是酶大规模生产中最常用的技术，通常在具有可溶性底物的流动液体中进行发酵。丝状真菌如曲霉、青霉和木霉通常在固体培养基中产生大量的纤维素酶，但生产中控制过程参数、过程监测和下游处理等的简易性使液体发酵更为常用。在该技术中，pH、温度、底物浓度、诱导剂和培养基组成等各种因素显著影响纤维素酶的产生。其主要缺点是需要较长的发酵时间而产量较低。在微生物中，最常使用细菌液体深层发酵生产纤维素酶，但是也可在液体深层发酵下培养一些真菌如曲霉、青霉、木霉等，用于生产纤维素酶。
真菌的纤维素分解活性可以根据培养基以及培养条件而改变。为了提高生产效率，在液体深层发酵中使用各种合成或天然碳源。例如，Acharya等在28℃、pH4～4.5、r/min和以蛋白胨作为氮源的条件下观察到黑曲霉纤维素酶的最高活性。同样，Karthikeyan等研究了青霉菌生产纤维素酶。在添加果糖和硝酸铵、pH3.0和30℃条件下，表现出最大的纤维素酶活性。在多种碳源和氮源条件下，黑曲霉生产纤维素酶的最大产量是在补充1%羧甲基纤维素或锯末的察氏培养基、pH5的条件下获得。
1.2 纤维素酶固态发酵
纤维素酶固态发酵是酶在工业生产中的重要途径。固态发酵不仅有助于将农业废弃物生物转化为增值产品，而且能够以更少的能源消耗有效地回收利用木质纤维素材料。此前，固态发酵仅适用于食品领域产品的发酵，但进一步的研究表明这种技术具有在低成本条件下高效产酶的优势。固态发酵较低的资本投资和运营成本使其利于纤维素酶生产商业化。由于固态发酵的离散性质，底物的物理化学特性如结晶度、床孔隙率和表面积会影响真菌培养物中纤维素分解酶系统的产生。在固态发酵中，温度、pH和含水量等条件是影响微生物生长和纤维素酶产生的关键因素。
农业废弃物如小麦和大米的麸皮，玉米、小麦和大米的秸秆，甘蔗渣，锯末等是生产纤维素酶最常用的底物。例如，Liu等研究了针对不同的木质纤维素底物，如水稻、小麦、棉花或玉米秸秆、玉米芯，使用烟曲霉生产的纤维素酶进行预处理，以玉米芯为底物实现内切葡聚糖酶的最大产量，刺糙青霉在含有预处理甘蔗渣和麦麸组合的培养基上显示出纤维素分解酶的最大产量。Dutta等研究用小麦和大米的麸皮、稻草作为底物来生产桔青霉的纤维素酶，所有这些基质都支持纤维素酶的生产。黄曲霉BS1能够有效利用不同的木质纤维素底物。
1.3 两种发酵方法的比较
相比于液体深层发酵生产纤维素酶，固态发酵可以更有效地生产。固态发酵有三个优点：降低水和能源消耗；减少废物产出；可生产更高浓度的产品。此外，液体深层发酵过程中纤维素酶的产生受到分解代谢和最终产物抑制，而固态发酵系统可显著避免这些不利因素，因此更具有经济性（表1）。
表1 纤维素酶液体深层发酵及固态发酵比较
1.4 纤维素酶生产模式
在工业发酵过程中，微生物吸收营养物质生产纤维素酶。生产过程通常受两个主要因素影响，即生产位置和生产原料。传统的纤维素酶生产设施远离纤维素乙醇工厂，采用中央工厂式统一集中生产，而且一般使用葡萄糖作为主要营养成分；而集成生产模式通过使用纤维素生物质代替葡萄糖以降低成本。纤维素酶生产的模式有以下三种。
①异地生产模式。在这种方法中，纤维素酶在中央工厂生产并运往纤维素乙醇生产现场。主要原料是葡萄糖、主要辅助原料是含有氮、磷和钾的混合物。玉米浆也可以作为蛋白质来源添加。发酵罐产物为含有纤维素酶和其他蛋白质的混合物。为了在运输期间保持纤维素酶的活性，需要将其纯化，之后通过物流将纤维素酶运输至乙醇生产工厂。
②现场生产模式。纤维素酶的生产方法基本与非现场模式相同，只是纤维素酶工厂独立位于乙醇工厂附近。近距离运输减化了纯化步骤，可将蛋白质混合物直接进料至乙醇装置中。现场模式的纤维素酶生产规模需要匹配乙醇工厂的需求，因此纤维素酶的生产规模一般小于非现场模式。
③集成生产模式。将纤维素酶生产及乙醇生产整合。以纤维素替代葡萄糖作为纤维素酶生产的主要原料。该工艺能更好的优化菌株、底物和产物等生产环节，实现相互促进，提高效率。
虽然诺维信公司仍致力于异地生产模式，但其他行业参与者，如Dyadic、杜邦和帝斯曼公司已转向现场生产模式。现场生产模式可显著降低物流成本并简化供应链，可以生产具有针对性的酶组合物，来水解特定生物质原料，包括玉米秸秆、小麦秸秆、高粱、木浆和其他能源作物在内的各种原料及其组合，确保反应在最佳条件下运行。
1.5 纤维素酶及纤维素乙醇生产成本
纤维素酶生产成本是影响纤维素乙醇生产成本的重要因素。纤维素酶生产商Dyadic、诺维信和杜邦等公司近年来通过不断研发纤维素酶生产技术，以降低纤维素酶成本在纤维素乙醇总成本中的占比。目前每加仑纤维素乙醇中纤维素酶的成本已从年的近2美元降低至约0.30美元（1加仑＝3.升）。
纤维素酶生产模式变化同样影响纤维素乙醇生产成本。传统纤维素酶异地生产模式无法实现纤维素酶成本的实质性降低，纤维素乙醇生产商已采用自有技术或以技术许可方式现场生产纤维素酶。有数据显示纤维素酶成本分别占异地模式、现场模式及集成模式的28%、22%和10%。而将异地生产模式转变为现场生产模式或集成生产模式，则能够分别降低纤维素酶生产成本8%和20%，分别降低纤维素乙醇生产总成本7%和19%。因此实现纤维素酶的本地化生产是纤维素酶及纤维素乙醇成本实质性下降的关键所在。
表2 应用于生物炼制的纤维素酶产品及供应商
2 纤维素酶市场分析
里氏木霉的现代基因修饰菌株与20世纪末通过随机诱变获得的典型菌株有很大不同。基于里氏木霉的新型商业纤维素酶制剂通常不仅包括天然木霉蛋白酶、同源工程酶，也含有在真菌宿主中异源表达的天然酶或工程酶。诺维信公司的Cellic.CTec3和杜邦公司的Accellerase.TRIO即是通过上述现代基因技术所研发纤维素酶的先进代表。目前纤维素乙醇示范设施多数以诺维信或杜邦公司为纤维素酶供应合作伙伴，但也有少数工厂会使用其他公司的纤维素酶，例如帝斯曼（DSM）、Dyadic和科莱恩（Clariant）公司等。
诺维信公司为世界主要的纤维素酶供应商，生产包括纤维素酶和半纤维素酶等。世界上第一家商业纤维素乙醇生物精炼厂于年在意大利Crescentino建成，纤维素乙醇年产能达万升。该工厂采用BetaRenewables公司的PROESA预处理技术与诺维信公司的Cellic.系列酶制剂，以农业废弃物如稻秆、麦秆和芦竹作为原料。GranBio公司在巴西Alagoas的纤维素乙醇工厂于年9月投入运营。该工厂建有当时世界上最大的纤维素乙醇设施，由诺维信公司提供纤维素酶生产技术，计划年产乙醇万升。工厂使用甘蔗秸秆和甘蔗渣为原料，拥有收储40万吨原料的能力。年，壳牌公司与巴西Cosan公司成立合资公司Raízen，建立纤维素乙醇工厂，计划年产乙醇万升。工厂使用甘蔗渣和秸秆作为原料，并由诺维信公司提供纤维素分解酶。
Dyadic公司拥有基于嗜热毁丝霉菌株的C1酶技术平台。Dyadic公司开发由M.thermophilaC1菌株经遗传修饰生产的纤维素酶AlternaFuel.CMAX系列应用于木质纤维素水解。同基于里氏木霉的纤维素酶产品相比，M.thermophilaC1纤维素酶具有更广泛的pH和温度适用范围，并且不易受葡萄糖抑制的影响。此外，M.thermophilaC1半纤维素降解酶和多糖单加氧酶的基因组比里氏木霉的更加丰富。多糖单加氧酶可以作为纤维素酶活性的增强剂，已经成为用于木质纤维素生物质降解的酶组合标准组分。Dyadic公司与Abengoa和Codexis公司签署了非独家许可协议，授权其使用C1技术平台生产纤维素酶。年，Abengoa公司在西班牙的生物能源示范设施，以小麦和大麦的秸秆为原料生产乙醇，其产量为万加仑/年。Abengoa公司在堪萨斯州的工厂于年10月投入运行，工厂使用玉米秸秆残渣为原料，采用专有技术将生物质转化为乙醇，年生产乙醇万升。
DSM公司开发基于嗜热丝状真菌Rasamsoniaemersonii的纤维素酶组合，并同POET公司成立合资公司——POET-DSM，该公司的商业纤维素乙醇工厂于年9月在爱荷华州投入运营。工厂以玉米秸秆为原料，计划年产万升乙醇，并于年计划建立纤维素酶现场生产设施以适应技术发展、降低成本。
科莱恩公司自年起研发Sunliquid?纤维素乙醇工艺，该工艺特点是可低成本生产纤维素酶，有效水解秸杆中含有的糖，可将C5和C6同时发酵及乙醇分离的方法高效节能。自年起，科莱恩公司在德国的预商用工厂正式用于生产纤维素乙醇。经过5年试运行，现在生物质乙醇的产量可达到吨/年。作为项目的第二阶段，于年在欧洲开设了两家商业化工厂。一家是位于罗马尼亚的全资工厂，纤维素乙醇年产量预计可达5万吨；另一家是位于斯洛伐克的合作方的工厂，科莱恩公司采用技术许可模式授权合作伙伴使用其专有纤维素酶和酵母平台。
杜邦公司开发了基于里氏木霉的第二代纤维素酶产品。杜邦公司为进一步稳固其在生物能源领域的领先优势地位，于年收购了Dyadic公司的酶技术及产品，其中包括了C1酶技术平台。年7月，杜邦公司和吉林省新天龙实业股份有限公司共同宣布达成一项特许协议，将应用杜邦公司的纤维素乙醇工业化生产技术和杜邦Accellerase二代纤维素酶，并采用在吉林玉米种植所产生的秸秆来生产可再生燃料。年10月，杜邦公司在爱荷华州内华达市建设纤维素乙醇工厂，每年可生产约1.2亿升乙醇。工厂使用玉米秸秆作为原料，通过与当地农场合作，每年消耗37.5万吨玉米秸秆。
3 总 结
经过数十年对纤维素利用的研究，现在人们普遍认为，基于酶的纤维素生物质转化技术具有出色的经济和环保优势。纤维素酶的成本是生物质转化技术发展的主要障碍。目前纤维素酶生产厂商通过改进生产技术来降低纤维素酶生产成本，包括采用性价比更高的生物工艺技术、更廉价的基质等。商业化纤维素乙醇生产仍需要不断改进纤维素酶各个生产环节，以实现在技术经济层面更好的可行性。同时在微生物生理学和遗传学领域研究改进纤维素酶的生产技术，对其未来发展至关重要。
根据年国家发展改革委等十五部委联合发布的《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》，预计年燃料乙醇消费量至少达到0万吨。截至年年底，全国主要农作物秸秆产生量为9.84亿吨，可收集资源量为8.24亿吨。以农作物秸秆和林业废弃物等纤维素原料，利用纤维素酶技术生产燃料乙醇的技术已从实验室阶段、工程示范阶段，逐渐朝商业化阶段发展。生产纤维素燃料乙醇可以避免“与人争粮”和“与粮争地”等问题，实现循环经济。通过对底物、产酶微生物及发酵工艺等技术的持续研发，将进一步降低成本，最终实现更高的生产效率、质量和更大的商业化规模。
全文刊登于《生物产业技术》年第4期
王恒哲等赞赏
