黑曲霉xynC基因编码一种低温酸性木聚糖酶
焦丛蕊1，杨文娟1，陈晓玲1，董自星2，金鹏2，刘晓光2，王正祥1,2*
1(天津科技大学生物工程学院，天津，)2(天津科技大学化工与材料学院，天津，)
摘要木聚糖酶(xylanase,EC3.2.1.8)可以随机切割木聚糖主链的β-1,4-糖苷键，在饲料、食品、造纸和纺织等领域具有广泛的应用。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIMF来源的木聚糖酶基因xynC在毕赤酵母中进行了克隆表达，构建获得了重组菌GS(pPIC-XynC)。在摇瓶水平上，重组菌的酶活为1.14U/mL。酶学性质的研究表明，重组酶XynC的最适反应温度和pH分别为30℃和2.5，且它在25～40℃或pH2.0～5.0有较好的稳定性；K+对XynC的活性有微弱的促进作用，而Ca2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Sn2+、EDTA和SDS等对XynC的活性有不同程度的抑制作用。此外，该酶还可以水解戊聚糖产生聚合度为3～6的低聚木糖。这些良好的理化性质为重组酶XynC在饲料及食品等领域的应用奠定了基础。
关键词低温酸性木聚糖酶；黑曲霉；分子克隆；酶学性质；低聚木糖
内切-1,4-β-D-木聚糖酶，简称木聚糖酶(xylanase，EC3.2.1.8)，是降解木聚糖的关键酶，它可以随机切割主链的β-1,4-糖苷键，从而产生不同长度的低聚木糖[1]。该酶广泛应用于饲料、食品、造纸、纺织以及能源等诸多工业领域[2-3]。当前，木聚糖酶主要通过真菌、细菌等微生物发酵生产获得[4]。而国内主要由真菌经固态发酵生产木聚糖酶，其酶活较低，且成分复杂，限制了木聚糖酶的广泛应用。因此，通过分子克隆技术实现木聚糖酶的异源表达成为近年来的研究热点。目前已有多种木聚糖酶被克隆及表达，其中黑曲霉来源的XynB[5-7]和XynI[8-10]已经在毕赤酵母、黑曲霉和大肠杆菌等多种宿主中得到了克隆表达，它们的酶学性质也被系统地解析。
尽管黑曲霉CBS.88的基因组序列已经于年被解析完成并公布[11]，但黑曲霉的蛋白数据库中还有许多蛋白的功能未确定。本课题组前期通过对其基因组序列信息进行分析，发现了一个新的编码木聚糖酶的基因xynC，其理化性质与功能等未知。为此，本研究通过分子克隆技术将其在毕赤酵母中进行克隆表达，并对其进行了初步纯化，还就其生化特征进行了全面解析，为其大规模生产及其在饲料及食品行业的应用奠定了基础。
1材料与方法1.1菌种
黑曲霉(Aspergillusniger)CICIMF为从自然样本中分离保藏的野生菌株，由本实验室保藏[12]。重组毕赤酵母菌GS(pPIC-XynC)由本研究中构建、筛选并保存。大肠杆菌JM由本实验室保藏。黑曲霉采用CD培养基进行培养；大肠杆菌用LB培养基进行培养；毕赤酵母及其重组菌的培养基及其培养方法按照Invitrogen的毕赤酵母操作手册进行。
1.2主要试剂
限制性酶、质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒以及胶回收试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司；G、无氨基酵母氮源等为Invitrogen公司产品；RNA抽提试剂盒(HighPureRNAIsolationKit)和cDNA合成试剂盒(TranscriptorHighFidelitycDNASynthesisKit)由Roche公司提供；生物素、胰蛋白胨和酵母抽提物等购于英国OXOID公司；戊聚糖购自陕西帕尼尔生物科技有限公司；D-木糖和低聚木糖为江苏锐阳生物科技有限公司产品，其他试剂均为国产分析纯。
1.3黑曲霉木聚糖酶基因XynC的克隆与表达
1.3.1毕赤酵母工程菌的构建
质粒、PCR产物的纯化、酶切、连接、电转化以及转化子筛选等均采用实验室常规方法[13]。其中，基因克隆过程中所采用寡核苷酸引物(An-XynC1：GTACTCCCCAATGGCAAGGCCC；An-XynC2：TGCTC￣T￣A￣G￣A￣TTAGCAGCTCTCCTCGGTGCTGTC；下划线部分为人工引入的限制性酶切位点)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。黑曲霉总RNA的提取与cDNA的制备按照试剂盒说明书进行。
1.3.2重组酶的诱导分泌表达与初步纯化
将毕赤酵母重组菌GS(pPIC-XynC)在YPD平板上进行纯化，挑取单菌落接种于25mLYPD液体培养基中，30℃、r/min振荡培养至对数生长期(OD为2～6，约18～20h)。按1%(v/v)接种量接入50mLBMGY培养基中，于30℃、r/min振荡培养至对数生长期(OD为2～6，约16～18h)。室温下r/min离心5min回收酵母细胞，弃上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD值为1.0，30℃继续培养并开始诱导。每隔24h补加%甲醇至终浓度为0.5%以维持诱导，并同时取样测定酶活，直至酶活不再提高。
发酵结束后，离心(r/min，15min，4℃)收集粗酶液。采用盐析、透析和SephadexG-75凝胶层析柱对其进行初步纯化，并通过酶活测定和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电脉(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析蛋白的纯化情况。[14]采用5%的浓缩胶，12%的分离胶。
1.4重组木聚糖酶的酶学特征分析
1.4.1酶活测定方法
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[15]测定木聚糖酶的酶活。反应体系为μL50g/L戊聚糖溶液、μL相应pH的缓冲液和μL经适当稀释的酶液，在50℃反应30min后，加入μL0.5mol/LNaOH溶液终止反应。离心后，取μL反应上清液，加入μL去离子水和1mLDNS试剂，沸水浴5min后，迅速冷却。再用去离子水定容到5mL，测nm下的吸光值；对照组中预先加入μL0.5mol/LNaOH溶液灭酶活，然后于上述条件下反应，测定吸光度。酶活力定义：1mL酶液在50℃、pH5.5条件下，每分钟水解戊聚糖生成1mg还原糖为1个酶活力单位(U)，用U/mL表示。
1.4.2最适反应温度的测定
在不同温度条件下(25～70℃)测定重组木聚糖酶的酶活，以酶活最高者为%表示所处温度下的相对酶活。
1.4.3热稳定性的测定
分别将木聚糖酶的酶液在不同温度下(25～70℃)进行孵育，于不同时间(15、30、60和min)取样，测定重组木聚糖酶的酶活。以未进行热处理的酶液的酶活为%，计算相对酶活，确定重组木聚糖酶的热稳定性。
1.4.4最适反应pH的测定
在不同反应pH下(pH2.0～8.0)测定重组木聚糖酶的酶活，以酶活最高者为%表示所处pH下的相对酶活。所用缓冲液为：pH2.0～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
1.4.5pH稳定性的测定
室温下，分别将经过适当稀释的木聚糖酶酶液在pH2.0～7.0的缓冲液中孵育1h后，按照1.4.1的方法测定酶活。以酶活最高者为%计算残余酶活力，确定重组酶的pH稳定性。
1.4.6金属离子和相关化学试剂对酶活的影响
在木聚糖酶与其底物进行反应的体系中，加入终浓度为5mmol/L的不同金属离子或化合物，分别测定各反应体系中重组木聚糖酶的相对酶活，以不加金属离子或化学试剂的反应体系的酶活为%。
1.5重组酶水解戊聚糖的产物分析
1.5.1水解实验
将μL50g/L戊聚糖溶液与μL酶液混匀，在最适反应温度和pH条件下反应10h后，煮沸灭酶活。然后在10r/min离心5min，取上清液。
1.5.2水解产物薄层层析
将上述上清液采用薄层层析进行分析。所用的展开剂为:V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)∶V(异丙醇)∶V(甲酸)∶V(水)=25∶10∶5∶1∶15[16]，显色剂为：V(硫酸)∶V(无水乙醇)=5∶95。从左到右依次点样：木糖标品(1mg/mL)、低聚木糖标品(1mg/mL)、XynC与戊聚糖反应的上清液、灭活的XynC与戊聚糖反应的上清液。将已经点好样的硅胶板放入盛有适量展开剂的层析缸中，待展开剂扩散至距硅胶板上沿1cm处，取出硅胶板，在通风厨里晾干。向此干燥的硅胶板上快速均匀的喷洒显色剂，在通风橱里晾干，然后烘烤至样品显示出来，并拍照记录。
1.6木聚糖酶基因XynC的生物信息学分析
从美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)(新媒体总监北京中科中医院好不好
