焦天慧，吕长鑫*，冯叙桥*，李萌萌，刘苏苏，芦宇，纪秀凤，曹敏杰
(渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州,)
摘要：单宁酶是一种广泛存在于自然界中的水解酶，可将没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键水解，生成没食子酸和葡萄糖。由于单宁等多酚类物质可与蛋白质、咖啡碱等通过疏水作用及氢键形成络合物进而形成沉淀，所以单宁酶不仅在饮料澄清领域得到了广泛应用，也在皮革制造、饲料及化妆品生产中发挥着极大作用。目前，单宁酶主要由真菌类的曲霉属和青霉属发酵制得，少数细菌、酵母也可产生。美国FDA已确认单宁酶为安全的食品添加剂，我国卫生部也将单宁酶加入食品添加剂目录。文中综述了单宁酶的主要性质、提取与纯化方法及其在软饮料工业中的应用，分析了单宁酶在软饮料工业中的应用现状及存在的问题，并结合实际展望了单宁酶的未来发展和应用。
关键词：单宁酶；分离纯化；软饮料工业；应用
单宁酶(Tannase,EC3.1.1.20)全称单宁酰基水解酶(Tanninacylhydrolase)，是一种能够水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键并生成没食子酸和葡萄糖的水解酶[1]。单宁酶广泛存在于动物、产单宁植物及微生物中，在饮料、精细化工、皮革、化妆品、饲料领域有着广泛的应用。随着其应用范围逐渐扩大，自然界中产单宁酶菌株的筛选愈发深入，基因工程技术也被用于构建单宁酶高产菌株。单宁酶也是一种诱导酶，微生物在单宁酸存在的情况下会诱导产生单宁酶。因此，单宁酶的生产过程中通常以单宁酸为诱导物，依靠液体发酵法或固体发酵法进行生产[2]。
美国食品药品监督管理局(FDA)已确认单宁酶是一种安全的食品添加剂[3-4]，日本等多个国家均已批准将其应用于食品工业，我国卫生部发布的年第26号公告中也将单宁酶加入食品添加剂目录。在软饮料工业尤其是茶饮料工业中，单宁酶发挥着不可替代的作用。此外，单宁酶在果汁饮料、固体饮料等产品加工中也得到了广泛的应用[5]。本文综述了单宁酶的性质、提取纯化技术及其在软饮料工业中的应用现状，分析了单宁酶在生产应用中存在的问题及发展趋势，以期在软饮料工业中更好地应用单宁酶提供参考。
1单宁酶的性质1.1单宁酶的理化性质
纯品单宁酶为白色或淡黑色粉末，溶于水而不溶于乙醇[6]。质量分数10%的纯品单宁酶溶液在波长为nm处有最大吸收峰(比色皿规格为1cm×1cm)，吸光系数可达11.8[7]。
单宁酶是一种糖蛋白，PARTHASARATHY等[8]利用黑曲霉在培养基中进行发酵，将发酵所得的单宁酶进行纯化，并发现所得单宁酶的糖基为葡萄糖和甘露糖，其肽链与糖基是通过苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)相连。此外，不同来源单宁酶的相对分子质量也有较大差异。FARIAS等[9]通过板栗疫病菌发酵所得单宁酶的分子质量可达kDa。郭鲁宏等[11]对黑曲霉发酵所得单宁酶进行研究，结果发现其分子质量为58kDa。而王征等[12]对黑曲霉中提取到的单宁酶进行SDS-PAGE法检测，测得其两个亚基的分子质量分别为75.9kDa和60kDa。
1.2单宁酶的酶学性质
由于单宁酶的组成与结构同样受到来源的影响，所以不同菌种发酵所得单宁酶的酶学性质也有所不同。表1列举了几种产单宁酶的细菌、酵母菌、真菌，并简单总结了各菌种所得单宁酶的酶学性质。
由表1可知，不同菌种所产单宁酶的最适pH与适宜温度范围均有一定差异，这与不同单宁酶的结构和组成有关。首先，不同发酵菌株所得单宁酶的分子链和糖链有所差异，其酶蛋白通常由2～8个单体聚合而来，糖基含量在12%～62%之间。此外，OSAO[10]等对黄曲霉发酵所得单宁酶的结构特性进行了细致研究，发现其分子中氮含量为12.9%，并通过二硝基氟苯法对氨基末端进行检测，结果表明此单宁酶有2个DNP-氨基酸产物，初步证实了单宁酶是由2种亚基组成。在OSAO之后，BARTHOMEUF等[4]对黑曲霉LCF-8菌株所产单宁酶进行研究，结果发现其分子量可达kDa，将其纯化后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，进一步证实了该单宁酶由两种亚基组成。因此，在单宁酶的生产和应用中，应根据所需单宁酶的具体性质同时结合微生物的生长特性来选择较为适宜的菌种。
表1产单宁酶菌株及所得单宁酶的酶学性质
Table1Originandenzymologypropertyoftannase
2单宁酶的分离及纯化2.1单宁酶的分离及纯化方法
单宁酶的生产主要包括固体发酵法和液体发酵法，固体发酵法可得到胞外单宁酶而液体发酵法通常得到胞内单宁酶[36,63]。发酵所得单宁酶类型不同，对其提取方法也不同。胞外单宁酶可直接利用水或缓冲溶液进行浸提[34]；而胞内酶与菌体结合紧密且大多分布于菌体细胞壁与细胞膜之间，需要对菌体进行破坏进而使单宁酶释放出来[64]。破坏菌体细胞壁常用的方法包括酶法、冻融法、超声波法、石英砂研磨法以及渗透法等[12,36]。李秧针等[35]利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液对黑曲霉发酵所得的单宁酶进行了浸提，并通过硫酸铵两次沉淀法对所得粗单宁酶进行初步纯化，最终得到了60℃内稳定性良好的单宁酶，且Zn2+、Mg2+、吐温80和EDTA等对其酶活力无明显抑制。BARTHOMEUF[4]等先利用冻融法(在-18℃冷冻一夜后，之后在室温下解冻)对黑曲霉菌体细胞处理，再加入伴刀豆球蛋白对菌体细胞壁进行破坏，从而使结合于菌体内的单宁酶释放到缓冲液中。也有研究者将产几丁质酶、α-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶的菌种与产单宁酶菌种共同培养，利用微生物产生的酶对产单宁酶菌体进行破坏，这种破壁方法虽然能够得到较高的提取率，但是提取物中杂质较多[36]。上述几种提取方法均对单宁酶的溶出有良好的效果，且针对胞内单宁酶的提取手段主要依靠物理、化学或生物手段对菌体细胞壁进行破坏，进而使单宁酶溶出，但破壁过程中会产生蛋白和多糖等杂质。
由于微生物发酵所得单宁酶粗提液中混有较多杂质，这些杂质会影响单宁酶的催化效果与稳定性，同时为了避免使用过程中不必要的反应，需要对粗单宁酶进行纯化。在纯化过程中，需要根据单宁酶不同的组成结构、分子量、等电点等特点进行纯化方法的选择[37]。常用于单宁酶纯化的方法包括超滤法、硫酸铵沉淀法、葡聚凝胶层析法、DEAE-纤维素层析法等(表2)。
表2单宁酶纯化方法
Table2Methodsoftannasepurification
一般来说，单一的纯化方法常常达不到满意效果。就已报道的纯化技术来看，通常选择几种纯化方法联合使用可以一定程度提高单宁酶的纯度。倪田表等[41]对黑曲霉发酵所得单宁酶进行了超滤法和葡聚凝胶层析法联合使用，纯化后的单宁酶可达到电泳纯。王征[37]和王维维[39]均通过硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及葡聚凝胶层析联合纯化黑曲霉发酵液中的单宁酶，并使该单宁酶纯度达到了电泳纯。FARIAS等[9]通过阴离子层析与凝胶层析结合的方式对栗疫病菌所产单宁酶进行了纯化，使该单宁酶纯度得到了显著提升。BATTESTIN等[28]对宛氏拟青霉所得单宁酶进行了纯化，所选纯法方式为硫酸铵沉淀和DEAE-纤维素层析联合纯化。虽然几种纯化方法的联合使用可以显著提高单宁酶的纯度，但纯化工艺复杂且纯化效率低。目前还未见对特定单宁酶的纯化方法进行筛选的研究，若能根据单宁酶特性来确定纯化手段并优化纯化工艺，将会有力地推动单宁酶纯化技术的发展，为单宁酶更为广泛的应用提供理论依据。
2.2单宁酶活力的测定
单宁酶的纯化效果好坏，主要通过其酶活力的高低来评价。酶活力反映了酶催化某种化学反应的能力，测定原理是根据单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来测定的。对于单宁酶而言，可根据单位时间内底物单宁酸的减少量与产物没食子酸增加量来反映其酶活力。用于单宁酶活力的测定方法包括分光光度法、滴定法、视读法、高效液相色谱法以及气相色谱法(表3)等。
表3单宁酶活力测定方法
Table3Determinationmethodsoftannaseactivity
表3所示测定方法中以分光光度法应用最为广泛，相较于滴定法和视读法有着较高的准确性并且对人员和仪器的要求不高。IIBUCHI[23]于年开始通过紫外分光光度法测定单宁酶活力，主要利用单宁酶水解底物单宁在nm波长处吸光度的变化来反映底物浓度的变化，从而反映单宁酶的活力，该方法操作简单且可信度高，目前大部分研究均采用此法。BARTHOMEUF等[4]利用高效液相色谱法直接测定反应体系中的没食子酸甲酯，并以咖啡酸作为内标物，该方法有着较高的灵敏度与准确性，但操作复杂，对仪器和人员的要求较高，从而使这种测定方法的应用受到限制。
酶活力的测定主要是以检测酶催化底物和催化所得产物的变化效率来反映，而目前酶活力测定方法普遍存在检测精度高的手段其操作复杂程度较高，操作简便的检测手段其检测精度又不够理想。因此，对于单宁酶和其它酶活力测定方法需要向精明度高且操作简便的方向发展。
3单宁酶在软饮料工业中的应用软饮料一般指酒精含量低于0.5%vol的天然或人工配制的饮料，即非酒精饮料，也称无醇饮料。在我国果蔬汁饮料、茶饮料、碳酸饮料等均属于软饮料。由于软饮料本身具有极佳的口感并且可以通过额外添加营养物质以提高其营养价值，因此逐渐成为消费者生活当中不可或缺的一部分。但果蔬及茶叶中均含有单宁，不仅对加工工艺造成了一定困难，也对产品的感官品质产生了不利的影响。因此，利用单宁酶对果汁及茶汤中的单宁进行水解就得到了较为广泛的白癲风最有效治疗偏方白癜风用什么药物治疗
