mNGS在肺部真菌感染诊断中的应用

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重症肺言：mNGS对肺部真菌感染的诊断价值如何？

鲁炳怀教授：侵袭性真菌感染包括念珠菌属、隐球菌属、丝状真菌（主要包括曲霉属、毛霉目等）、肺孢子菌属（包括耶氏肺孢子菌）等。念珠菌少见引起肺部感染。诊断肺部真菌感染的传统的实验室手段比较单一，主要依靠显微镜检查（革兰染色、KOH、特殊染色，例如六胺银染色和荧光染色等方法）。①显微镜检方便、快速，不需要特殊的仪器和设备，特别适合在各级实验室开展。②可以直观观察该病原菌与炎性细胞的关系，是否有组织侵袭。③染色镜检手段的灵敏度通常相对较低，病原数量少时难以发现。荧光染色的灵敏度略高。如果能在显微镜下检出，常意味着此种病原菌数量较多，菌量多常与感染密切相关。④镜检需要工作人员有一定经验，经过适当的培训。⑤真菌镜检难以鉴定到种，有一定的误差率。

临床还会采用培养的方法，但有些真菌很难培养，如毛霉菌目，其实包括根霉属、毛霉属、横梗霉属、小克银汉霉属以及根毛霉属等。有时在显微镜检见到大量菌丝，但培养结果也可能是阴性的。对于耶氏肺孢子菌，目前实验室还没有相应的培养手段，该菌不会在培养皿上生长。隐球菌与曲霉菌相对容易培养。曲霉属与毛霉目真菌在周围环境中可见，也可以孢子形式被吸入呼吸道而定植，培养阳性不一定意味着感染，要注意区分。血清学的手段，包括G试验、GM试验、隐球菌荚膜多糖抗原试验、曲霉菌IgG抗体，用于不同肺部真菌感染的诊断，其中，隐球菌荚膜多糖抗原试验在诊断隐球菌感染中具有极重要的价值。

目前分子生物学检测真菌的手段相对较少，缺少可供临床使用的PCR试剂，主要原因在于真菌的细胞壁较厚，核酸提取较难。也是因为对于真菌感染的重视度不度，没有吸引厂家做此类产品的研发。宏基因组测序（mNGS）的临床应用也为肺部真菌感染的诊断提供了非常重要的手段，使临床诊断下呼吸道真菌感染的方法更加丰富，具有重要的临床价值。mNGS在不同真菌感染中的诊断价值略有差异。如果不在核酸提取方面下功夫，mNGS在检查细胞壁较厚、脂质成份较多的病原微生物时灵敏度有限，检测阴性不能排除感染。

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重症肺言：mNGS检出序列数低的真菌时，临床应如何解读？

鲁炳怀教授：临床上确实会遇到mNGS报告发现某一种真菌，包括曲霉属、毛霉菌目仅有几个reads或十几个reads，这种情况可能提示存在一些问题。①真菌本身细胞壁较厚，核酸提取相对比较困难。在原始样本中可能存在真菌，如果数量不多，核酸提取困难导致获得的核酸数量较较，反映在报告中就是真菌的序列数较少。②患者在治疗了一段时间后，本身真菌数量也会减少，但仍有一些游离核酸的存在，此时采集样本进行测序可能得到的只是病原微生物死亡后降解的核酸，这种情况检测出的真菌序列数也不会很多。③mNGS检测过程中，周围环境中的曲霉属、毛霉目等病原微生物被引入了检测流程，特别是在核酸提取的操作中。最终检测时，这些微生物的序列也可能会被检测出来，但其序列数相对较低。④测序时，一个芯片可能要检测多个患者的样本，假如某个芯片检测到某一患者样本的真菌序列数较高，理论上会污染其他患者的样本，但其总量较少，因此报告的序列数也就较少。⑤测序数据比对时，可能因数据库菌种的特征性序列选择不佳而出现误比对结果，会报告少量错误序列。通过上述几种情况，我们可以综合分析：首先，如果检出真菌的序列数较少，需要结合患者的具体情况和临床症状等。例如，患者免疫状况非常好，如果检测出序列数较少的耶氏肺孢子菌，也不能认为它就是致病菌，需要结合患者的症状、影像学特征、G试验的结果。其次，还应结合一些传统的检测手段（包括镜检、培养等）综合考虑。

临床中也常遇到一些情况，而且不是偶然现象，即在显微镜下已经见到大量菌丝，mNGS结果却是阴性的，这表明如果在提取核酸时不是采取特殊的破壁手段，即使原始样本中真菌数量很多，其检出的序列数也比较少，甚至报告阴性。当然还存在一些假阳性的情况，应结合患者的具体情况去考虑，必要时要采取其他方法来验证mNGS的检测结果。例如，如肺部样本mNGS隐球菌序列数，应通过隐球菌荚膜多糖抗原试验去验证，如为阳性则提示隐球菌属感染；如为阴性，应结合其他手段，包括肺穿刺组织镜检及培养等。如果mNGS检出真菌的序列数较大，而且有一定的覆盖率，常意味着有该真菌核酸的存在，进一步推断样本中有该真菌。目前很难给出具体的cutoff值，因为不同的厂家处理流程不同，不同原始样本的人源组织序列数据也相差很大。

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重症肺言：检测前接受抗感染治疗是否影响mNGS对致病菌的检出率？

鲁炳怀教授：真菌测序时检测的是核酸，但致病的是病原微生物。我们假设病原体已经死亡，其核酸还可能存续一段时间，存续时间与不同的病原体和患者的状况有关，一般为2~3周或者更长时间。所以从这个角度来说，如果短时间内使用抗真菌药物，理论上来讲影响应该不大；如果抗真菌药物使用时间长，肯定会有所影响。检出率随着给药时间的延长而下降。因为真菌已经死亡，其裂解产物会逐渐被排出体外，真菌核酸量自然也随之减少，所以还是建议在使用抗真菌药之前采集样本较为合适，但如果已经使用了抗真菌药，推测短期内的影响可能不大。

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重症肺言：为了提高肺部真菌感染mNGS检出率，对送检标本是否有一定的要求？

鲁炳怀教授：首先，检测样本要能够反映感染部位。真菌感染通常是下呼吸道感染，所以理想状态下，肺泡灌洗液是比较合适的样本。此时如果轻易地留取痰标本，特别是不合格的样本，杂菌多、干扰大，诊断价值就会大打折扣。如果采集鼻咽拭子，可能用来诊断早期呼吸道病毒感染，如果mNGS检出真菌，只能提示鼻咽部有真菌存在。对于真菌感染，我们还可以通过支气管镜看到病变部位，甚至可以见到一些菌团样或脓性的分泌物，采集此部位的样本较为理想，但应注意小心谨慎操作，避免在取样本时菌丝损伤下方的血管导致血管损伤。

肺泡灌洗液（BALF）是下呼吸道感染比较理想的送检样本，当然也要考虑其他一些情况，如果患者免疫状况较好，隐球菌和一些曲霉属等的感染部位病变局限，并不明显，真正的病变部位是通过影像学显示有病灶的部位。BALF未必会检测阳性。如果BALF检测结果不理想，但临床又高度怀疑，我们推荐在有条件的情况下穿刺取肺组织进行mNGS检测，这也是比较好的一种方法。但此类组织应同时送显微镜检及真菌培养，多种手段并用。肺组织因人源序列过多，mNGS灵敏度也不高。但如果患者病情很重，不能耐受肺泡灌洗及各种侵入性检查，可以采集血液样本，理由是肺部出现真菌感染时，这些病原菌会释放游离的核酸入血，所以可以通过检测血液中游离的核酸来推断肺部有无感染，如果血液样本中检出真菌序列，不一定代表病原体已经入血，只是说明其游离核酸已经入血，据此间接推断是否有其他部位的真菌感染。

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重症肺言：mNGS在肺部真菌感染诊断中的优势和劣势有哪些？对于肺部真菌感染，mNGS的检测效能是否优于传统检测技术？

鲁炳怀教授：目前对于真菌检测的手段比较单一，相对缺乏如PCR或恒温扩增分子诊断等单重或多重的检测手段，这时mNGS技术就显得尤为重要，因为有些真菌无法培养，例如耶氏肺孢子菌；而有些真菌很难培养，例如毛霉菌，即使在显微镜下见到，也不一定能够培养出来。对于毛霉菌目和曲霉属，显微镜检并不易区分类别，其临床处理措施，如是否需要外科介入、是否使用伏立康唑等，又存在很大差异。针对这种情况，mNGS就能体现出其独特的优势。但我们还要考虑一种情况，如果在检测过程中不进行特殊处理，由于真菌细胞壁很厚，会导致里面的核酸提取不出来，这时mNGS的灵敏度还不如传统的培养方法。mNGS和传统病原学检测技术各具优势。建议除非特殊情况，mNGS和传统病原学检测技术都要进行，互相验证：两种结果是否统一，是否与患者的病情、免疫状况、影像学表现相一致，这都有助于我们正确诊断。真菌检测仅依靠mNGS会给临床带来很大的困惑。尤其是曲霉、毛霉在周围环境中是存在的，在正常人/健康人的呼吸道也可能有这些菌的定植或核酸的残留，mNGS检测出这些真菌的序列并不意味着就是感染。国外文献表明，约有40%的不怀疑真菌感染的患者呼吸道的样本（痰）也可以检测出曲霉的核酸，只是微生物较少。应该综合多方因素去考虑，不同的技术联合使用可能会更好。对于不同的真菌，mNGS的检测价值也是不同的，比如耶氏肺孢子菌，其传统的病原学检测手段只有涂片染色，不能培养，其在正常人中可以定植，所以感染与否常与mNGS检测出的序列数密切相关。此外，mNGS还可以检测出巨细胞病毒。耶氏肺孢子菌和巨细胞病毒感染常在机体免疫功能低下时同时出现，这种情况下，mNGS会为病原学诊断提供很大的帮助。所以，mNGS和传统检测手段在下呼吸道真菌感染的诊断方面各具优势，也各有不足。两种方法联合使用，相互对比验证，可能是比较理想的检测方案。

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鲁炳怀教授

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