黑曲霉的分离纯化

黑曲霉广泛分布于世界各地粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉生长的最适温度为37℃，对营养要求较低，只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。

黑曲霉发酵糖类生成柠檬酸的能力很强，其主要特征是耐酸性极强，在pH为1．6时仍能良好生长。利用其产酸高、耐酸强的生理特征，采用pH为1．6的酸性培养基即可分离该菌种。

1．材料

变质的馒头或发霉的柿子、霉烂的橘皮。

2．器具和其他用品

试管，锥形瓶（mL），玻璃珠，烧杯（mL、mL），量筒（mL），培养皿，接种环，酒精灯，电子天平（精确至0．01g），玻璃棒，试管架，吸量管（1mL、10mL），药匙，称量纸，量杯（mL），pH试纸（5．5～9．0），棉花，牛皮纸或报纸，记号笔，线（麻）绳，纱布，涂布棒，铁架台，橡胶管，弹簧夹，漏斗，剪刀，铅笔，电炉，镊子，载玻片，盖玻片，光学显微镜，擦镜纸，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台等。

3．试剂

硝酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钾，硫酸亚铁，蔗糖，琼脂，1mol／L氢氧化钠溶液，1mol／L盐酸，75%乙醇，纯净水。

1．黑曲霉分离样品的准备

将一个馒头（或柿干、橘皮）放入塑料袋中，一个手指伸入袋口，将袋口收起，用绳子扎住袋口及伸入的手指，抽出手指即可。室温（20±1）℃培养至长出菌丝及黑色孢子。

2．配制无菌察氏培养基

察氏培养基成分如表3－13所示。其中硝酸钠提供氮源；磷酸氢二钾是缓冲剂；硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁提供必须的离子；蔗糖提供碳源；琼脂是培养基的凝固剂。

3．菌种分离与纯化

1）菌种培养

取霉烂的馒头4cm2放入装有50mL无菌水的mL锥形瓶中，振荡3～5min。用无菌吸量管吸取稀释液0．5～1mL放入pH　1．7的察氏培养基上，涂布均匀，37℃培养3天。

2）分离菌种

在察氏培养基平板上用接种环划线。划线时，在近火焰处，左手拿皿，右手拿接种环在火焰上灭菌后蘸取平板上长好的菌丝一环，在平板培养基上连续划线。或者先在平板培养基的一边做第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线，再用同样方法第三次和第四次划线。划线的方法很多，也可以直接划平行线或蛇形线。无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将菌在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。划线接种时，动作要轻，以免划破培养基。

3）培养

划线完毕，合上皿盖，倒置培养皿（防止代谢产生的水流入培养基中引起污染），于培养箱中37℃培养24h。

4）纯化

按分离菌种的操作步骤，反复操作多次，直到得到单个菌落。

5）转接试管斜面

在超净工作台上，将装有斜面培养基的试管口于酒精灯火焰附近，迅速灼烧管口，并不断转动，使整个试管口都能灼烧灭菌（不能将棉塞烧掉，如果棉塞着火，立即用事先准备的湿抹布熄灭）。将试管管底夹入左手的拇指、食指与中指之间，培养基斜面朝上，用右手的无名指、小指和手掌边夹住棉塞并拔出。将接种环垂直插入酒精灯火焰中烧红，再横过火焰3次，放入有单菌落的培养皿中，在皿壁上停留片刻待其冷却。取单菌落的少许菌把菌种按蛇形线接种到斜面培养基上。取出接种环，将试管口和棉塞进行火焰灭菌，重新塞上棉塞。烧死接种环上的残余菌，将接种环放回搁架。在试管口上写明菌种名称、日期，置37℃恒温培养24～48h。接种多支试管斜面备用。