金枪鱼在加工过程中会产生大量副产物，如暗色肉、鱼皮等，其中含有丰富的蛋白质和生物活性物质，但副产物大多被加工成饲料鱼粉，利用率较低且造成环境污染。金枪鱼暗色肉整体呈红褐色并分布在体侧线附近，粗蛋白作为其主要构成占鱼体质量的21%～22%，粗脂肪含量经检测约为普通肉的3倍，富含多种不饱和脂肪酸，其中EPA和DHA含量占总脂的17%～20%，并且含有丰富的Ca、Fe、Zn等矿物质元素。但由于暗色肉肉质粗糙、腥味浓郁、难以加工和储存，因而一直被制成罐装宠物食品或被低值化加工成生产饲料。因此对此类副产物进行深入的开发利用，生产高附加值的产品具有重要意义。
宁波大学海洋学院的王锐、张迪雅、李晔*等人以金枪鱼暗色肉为原料，通过胰蛋白酶和碱性蛋白酶双酶酶解制备富含活性多肽分子的酶解液，并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪（MALDI-TOFMS/MS）测定酶解液中多肽分子质量，分析优势肽序列。进一步采用DiscoverStudio软件通过分子对接技术对酶解优势肽功能进行预测，并通过体外活性实验对多肽分子的抗氧化和降血压活性进行验证。以期为金枪鱼暗色肉高值利用提供理论参考和研究方向。
1、单因素试验结果
利用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对金枪鱼暗色肉进行酶解，以水解度为指标，通过单因素试验分别优化酶质量比、固液比、加酶量、酶解温度和酶解时间。结果如图1所示，水解度随着固液比、加酶量、酶解温度的增加以及酶解时间的延长总体呈现先上升后下降的趋势，确定最佳酶解条件为：酶质量比1∶1、固液比1∶4、加酶量2%、酶解温度50℃、酶解时间5h。
2、响应面试验结果
在单因素试验优化基础上，根据Box-Behnken设计确定暗色肉酶解条件：A酶解温度（45、50℃和55℃）、B加酶量（1%、2%和3%）、C酶解时间（4、5h和6h），响应面试验设计和结果见表1。利用DesignExpertV8.0.6软件进行多元回归拟合，得到双酶酶解时各变量的回归方程：Y＝59.05＋1.20A－0.30B＋0.11C－0.AB－0.AC＋0.BC－4.83A2－0.85B2－1.91C2。
由表2可知，金枪鱼暗色肉双酶水解的回归模型极显著（P＜0.01），且回归方程的失拟项不显著（P＞0.05），这表明酶解时间、酶解温度、加酶量对金枪鱼暗色肉水解的影响显著程度较高，并能与水解度同时进行高水平的拟合。此外，该模型的决定系数（R2）为0.，调整决定系数（R2Adj）为0.，都接近于1.0，表明该回归方程能对金枪鱼暗色肉双酶水解工艺结果进行很好的预测。由此可知，三因素水平设计合理、方法可靠、操作稳定，该模型可用作分析数据。如图2所示，3个因素与水解度呈抛物线关系，等高线呈椭圆状，表明各因素对金枪鱼暗色肉水解度的影响呈非简单的线性关系。回归模型各项的方差分析结果还表明二次项A2对双酶水解度影响高度显著，二次项C2对双酶水解度影响显著，其他因素则影响不显著。
综合响应面数学分析，确定最佳酶解条件为：酶解温度51℃、加酶量2%、酶解时间5h，水解度理论预测值为59.15%。采用上述优化酶解条件测得实际金枪鱼暗色肉水解度为61.01%。实验值与理论预测值具有较好的拟合性，表明此次响应面优化参数方案可应用于实践中。
3、金枪鱼暗色肉酶解多肽序列的分析结果
图3为一级质谱（MS）和二级质谱（MS/MS）处理的结果。MALDI-TOFMS/MS检测出2个相对较强的质谱峰，双酶酶解多肽中母离子m/z.的信号强度最高，m/z.信号强度次之，其余母离子信号强度偏低。故而，选择其作为母离子进行二级质谱分析，所得结果进行谱库对比，得到2个优势肽，分别为EPR（Glu-Pro-Arg）和VSSK（Val-Ser-Lys）。
4、酶解多肽（VSSK和EPR）的分子对接结果
VSSK、EPR多肽分子与Keap1的分子对接结果由表3可知，VSSK（63.kJ/mol）显示出比EPR（59.kJ/mol）同Keap1具有更高的亲和力。由图4A可知，VSSK参与同Keap1中的5个氨基酸残基相互作用，并与His、Lys、Lys和Cys共形成4个氢键；图4B表明EPR与Keap1中7个氨基酸残基相互作用，其中与Gln86和Cys形成2个氢键。
VSSK、EPR多肽分子与ACE的分子对接结果酶解多肽与ACE的分子对接结果见表4和图5。如表4所示，VSSK（75.kJ/mol）相较EPR（60.kJ/mol），与ACE的亲和力更为紧密。如图5A所示，可知配体小分子VSSK同ACE中的5个氨基酸残基相互作用，其中与Ala、Asp和Ser形成3个氢键；如图5B所示，可知配体小分子EPR与ACE中的5个氨基酸相互作用，分别与Asn66与Ala共形成2个氢键。由此可知，多肽VSSK和EPR通过与ACE蛋白相互作用形成氢键等作用方式，从而抑制ACE活性。此外，VSSK的对接能量-EC较EPR更大，表明其对ACE活性抑制发挥更强的作用，推测其具有更好的降压活性。
5、酶解液与合成多肽的体外活性比较结果
DPPH自由基清除活性金枪鱼暗色肉酶解液对DPPH自由基的清除率见图6。当质量浓度在0～0.5mg/mL变化时，DPPH自由基清除率变化幅度最大。比较酶解液与合成多肽的抗氧化活性，随着其质量浓度的增加，抗氧化活性也相对上升。阳性对照GSH的IC50为0.mg/mL，双酶酶解液的IC50为0.mg/mL，合成多肽的抗氧化活性相近，IC50分别为VSSK3.mg/mL、EPR3.mg/mL。与酶解液相比，合成多肽抗氧化活性相对较弱，在达到相近的DPPH自由基清除率前提下，需要更高的底物浓度。
ACE抑制活性酶解液与合成多肽的ACE抑制活性见图7。结果发现，阳性对照卡托普利的质量浓度从0增加到0.5mg/mL时，抑制率迅速上升至80%。此后，随着质量浓度增加，抑制率上升缓慢，其IC50为0.mg/mL。酶解液（IC50为2.mg/mL）与合成多肽的ACE抑制率曲线相似。当质量浓度从0升高到0.5mg/mL时，抑制率上升至27.89%，之后随质量浓度增加，抑制率缓慢提高；当质量浓度达到2.0mg/mL时，合成多肽VSSK的抑制率达45.25%，酶解液抑制率次之，为41.84%；当质量浓度达到3.0mg/mL时，酶解液抑制率达到最大（58.59%），合成多肽VSSK和EPR的抑制率分别为50.18%和43.51%。VSSK的IC50为2.mg/mL，而EPR的IC50为4.mg/mL。
结论本实验采用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对金枪鱼暗色肉进行双酶酶解，以提取生物活性肽，利用响应面法优化得到最佳酶解条件为：酶质量比1∶1、固液比1∶4、酶解温度51℃、加酶量2%、酶解时间5h，在此条件下测得金枪鱼暗色肉水解度为61.01%，较单酶酶解更高。通过MALDI-TOFMS/MS对酶解液进行氨基酸序列测定，得到EPR、VSSK这2个优势肽，利用DiscoverStudio软件中PharmaDB模块筛选出优势肽的靶标蛋白Keap1和ACE。通过分子对接，预测其具有良好的抗氧化活性和降血压能力。体外实验表明，酶解液较合成多肽具有更好的抗氧化活性和ACE抑制活性，推测与其中活性多肽的协同作用有关。本实验结果为金枪鱼暗色肉商业化利用与开发提供了研究方向。
本文《金枪鱼暗色肉酶解优势肽鉴定及其体外抗氧化和血管紧张素转换酶抑制活性分析》来源于《食品科学》年41卷23期91-99页，作者：王锐，张迪雅，李晔，苏秀榕。DOI:10./spkx---。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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