文章标题：ConstructionofanimprovedAspergillusnigerplatformforenhancedglucoamylasesecretion
发表期刊：MicrobialCellFactories
发表时间：年6月
影响因子：5.
引言
丝状真菌的生活方式依赖于将水解酶分泌到周围的介质中，这些酶将多聚物质降解成单体，然后被吸收以维持新陈代谢。生物技术已经利用这一特性建立了包括黑曲霉在内的高分泌能力的平台菌株。公认的模式是，蛋白质成为主要分泌在真菌菌丝的尖端。然而，对于丝状真菌中菌丝尖端的生长数量是否与分泌增加相关，仍然存在争议，尚未有研究表明两者存在正相关。
简介
生长中的真菌菌丝尖端被认为是蛋白质分泌最活跃的区域，持续的极化生长与菌丝尖端的蛋白质分泌之间的强相关性一直被普遍接受，然而，对黑曲霉和米曲霉的研究在评估活性真菌菌丝数量和分泌量之间的直接联系时，给出了相矛盾的结果。菌丝生长的特点是顶端延伸，是由生物合成酶及其底物的极化胞外作用所保证的，最终扩大细胞膜和细胞壁，传统分泌途径的中心是非堆叠的真菌高尔基体，因为它将蛋白质运往质膜、血管内系统或细胞外空间。
在黑曲霉中，研究发现黑曲霉幼菌丝和成熟菌丝的顶端优势也主要由RhoGTPaseRacA控制，该酶可介导菌丝顶端的肌动蛋白聚合和解聚合。黑曲霉RhoGTPasesRacA和CftA(Cdc42p)在菌丝顶端的肌动蛋白聚合上可以相互替代，但肌动蛋白解聚是由RacA而不是CftA完成的。由于ΔracA菌株的肌动蛋白分解受损，结果经常失去顶端优势，从而引发超分支表型。实验研究中将ΔracA菌株置于Tet-on系统的条件转录控制下，过表达一种同源且大量分泌的蛋白质。作者选择葡萄糖淀粉酶(glucan1,4-α-葡萄糖苷酶，GlaA)作为模型蛋白（是黑曲霉的主要分泌蛋白）对食品和生物燃料行业具有重要意义。
图文解读
图1野生型和超支化（ΔracA）背景中分泌囊泡的分布
用显微镜对每个菌株至少20个菌丝沿顶端20μm处的GFP-SncA荧光进行定量。发现后高尔基标记物SncA在近顶端区域的荧光分布最高。值得注意的是，在染色体glaA基因缺失后，囊泡数量显著减少，但在菌株MF19.5中，Tet-on驱动的glaA过表达后，观察到与野生型相同的分泌囊泡分布；对超分支ΔracA菌株MF22.4中分泌囊泡进行观察发现：在无glaA表达的情况下(?DOX条件下)，菌丝顶端可见较少的分泌囊泡。在glaA过表达(+DOX条件下)时，更多的分泌囊泡积聚在菌丝顶端。值得注意的是，后者的囊泡分布与之前在ΔracA菌株中获得的本地glaA表达完全重叠，表明了该方法的可重复性，而且再次强烈暗示了在顶端生长的菌丝可容纳的后高尔基体载体数量最大。
图2野生型和超支化（ΔracA）背景中分泌囊泡分布的多项式曲线近似
ΔracA突变体及其亲本菌株的GFP-SncA荧光曲线分别呈凸形和凹形，说明两株菌株分泌囊泡的数量和分布存在差异。
图3摇瓶培养中野生型和超支化(ΔracA)背景的生长概况和蛋白质分泌
菌株MF19.5(亲本菌株Tet-on-glaA，ΔglaA)和菌株MF22.4(Tet-on-glaA，ΔglaA，ΔracA)在50mLMM和完全培养基(CM)中培养18h，加入20μg/mLDOX诱导glaA转录，分别在诱导后0、24、48和72h测定生理参数，两株菌株生物量样品中总GFP-SncA荧光信号没有差异；且?racA菌株观察到更小和更紧密的菌丝团，更密集的分支。
图4重复DOX诱导
?racA(Tet-on-glaA，?glaA，?racA;MF22.4)及其亲本菌株(Tet-on-glaA，?glaA;本实验采用MF19.5)。每株5×孢子/mL接种于锥形烧瓶中，在30°C、rpm条件下培养18h。以20μg/mLDOX诱导产生葡萄糖淀粉酶。诱导后0、24、48和72h测定生理参数。实验数据表明，当菌丝尖端持续延伸不重要的分泌性物质被Tet-on驱动的过表达增加时，?racA超分支表型有利于向培养基中释放更多货运量，即GlaA。
总结
在本研究中，作者成功验证了这一假设，即?racA菌株过表达glaA基因会增加菌丝顶端后高尔基体分泌囊泡的数量，并最终导致高达4倍的glaA分泌量。因此，黑曲霉的菌丝生长数量与分泌量之间存在正相关关系，因为分泌蛋白的转录会受到Tet-on系统的控制。考虑到黑曲霉作为生产蛋白质、酶和代谢物的工业细胞工厂的巨大重要性，这项研究对生物技术具有深远的影响。基于本研究中获得的数据，作者提出了一个默认的racA缺失背景，高分泌菌株，以提高细胞外产品产量。
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