β-甘露聚糖酶为一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长。
引言：
β-甘露聚糖酶(β-mannanase,EC.3.2.1.78)的研究及应用一直是人们研究的热点。筛选出一株适应需要的β-甘露聚糖酶高产菌株并将其应用于生产实践研究显得至关重要。为了得到β-甘露聚糖酶高产菌株，通过诱变育种技术改造菌株为首选，目前诱变育种技术已在国内外多领域取得重要成果，并且表现出广阔的发展前景。
β-甘露聚糖酶是一类能够水解甘露寡糖、甘露多糖（含有β-1,4-D-甘露糖苷键）的内切水解酶[1]。近年来，自然界半纤维素资源的开发以及甘露寡糖生理功能的发现，使β-甘露聚糖酶的研究和开发成为热点，β-甘露聚糖酶产品已在食品[2]、医药[3]、饲料[4]等多个领域得到了广泛运用。β-甘露聚糖酶来源广泛，其成本低、活性好、来源稳定等优点使微生物来源的β-甘露聚糖酶成为国内外研究的重点[5-7]。
现阶段国内外学者主要集中于研究细菌中的芽袍杆菌[8-9]和真菌中的曲霉[10-11]产甘露聚糖酶，而对其他菌种的研究则鲜有报道。地衣芽孢杆菌能够产生胞外蛋白酶、纤维素酶以及淀粉酶[12-13]，被中国农业部列入允许使用的饲料级微生物添加剂，应用潜力较大[14]。
紫外线是最常用的物理诱变剂，它能诱发微生物突变的有效波长范围为~nm，作用波长为.7nm。利用紫外诱变可选育出大量产量高、活性强的优良微生物菌种，其优点是操作简单，经济实惠，还能够有较高几率出现正突变。廖晓霞等[15]、吕志伟等[16]、罗强等[17]均运用紫外线对菌株进行了改造，试验所得效果显著。本研究通过2轮紫外线诱变，提高地衣芽孢杆菌HDYM-04产生β-甘露聚糖酶的能力，以期能更好为生产实践提供试验指导。
1材料和方法
1.1材料
地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)HDYM-04由本实验室保存；魔芋粉，购自新星魔芋粉场；NaCl、蛋白胨、酵母提取物、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH、MgSO4、K2HPO4、丙酮、刚果红、琼脂、NaHSO3、酒石酸钾钠、苯酚、3,5-二硝基水杨酸、乙醇、柠檬酸、魔芋粉，均为国产分析纯。
1.2主要设备
紫外可见分光光度计；柜式恒温冷冻摇床HQLA；电热恒温水浴锅DK-S26；生物安全柜CLASSⅡTYPEA2；台式离心机TGL-16G。
1.3培养基
种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。
发酵产酶培养基：魔芋粉1%、蛋白胨30g/L、K2HPO4?3H2O5g/L、MgSO4?7H2O0.2g/L。
平板筛选培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L。
刚果红初筛培养基：魔芋粉1%、蛋白胨30g/L、K2HPO4?3H2O5g/L、MgSO4?7H2O0.2g/L、琼脂20g/L。
1.4实验方法
1.4.1菌种选育程序出发菌株→纯化→扩大培养→制备单孢子悬液→诱变处理→梯度稀释→涂平板→将单菌落点种至初筛平板→刚果红染色初筛→3次重复培养→摇瓶复筛→测定β-甘露聚糖酶活力。
1.4.2粗酶液的制备在活化后生长饱满的斜面挑取一环，接种于mL/mL种子培养基，37℃条件下振荡(r/min)培养8h。吸取菌液，按1%的接种量转接于mL/mL的发酵培养基中，37℃、r/min振荡培养12h。取适量发酵液于离心机中，r/min离心5min，上清即为β-甘露聚糖酶粗酶液。
1.4.3酶活性测定（DNS法）采用田雪[18]的方法，在25mL具塞比色管中，加入0.1mL酶液和0.9mL0.5%(w/v)去除还原糖的魔芋粉溶液（Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制，pH4.0）。55℃水浴30min，加入3mLDNS试剂，沸水中煮沸5min，加水定容至25mL，混匀后在波长nm下测定。每次做有底物无酶的空白试验，加入魔芋粉的样本需在定容后离心。通过公式(1)计算β-甘露聚糖酶活力。
1.4.4菌悬液的制备取纯化后生长至对数生长后期的斜面转接至种子培养基，37℃，r/min培养8h，离心(0r/min,10min)收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2~3次，再加入无菌生理盐水制成菌悬液，调整菌浓度为个/mL。
1.4.5紫外线诱变条件的确定吸取3mL菌悬液于6cm的无菌培养皿中，放入无菌大头针后置于磁力搅拌器上，将紫外线照射功率设置为10W，照射时间为10s，照射距离分别为0、20、30、40、50、60cm。将经过照射的菌悬液10倍稀释至浓度为10-6个/mL，取0.1mL稀释液涂布在筛选培养基平皿上，37℃避光恒温培养12h。单菌落计数，以致死率来确定最佳诱变距离，致死率计算见公式(2)。
致死率=（未经处理组菌落总数-处理后的菌落总数）/未经处理组菌落总数×%…(2)
选择致死率为70%~80%的照射距离，分别搅拌照射0、3、5、10、15、20s，梯度稀释后，选择合适的稀释度同时涂布于初筛平板，分别计算各处理时间下的致死率，正、负突变率及总突变率。
1.4.6β-甘露聚糖酶高产菌株的筛选
（1）初筛：根据常伟[19]的方法，将诱变后的单菌落点种于刚果红初筛培养基上，37℃倒置培养10h。在平皿上加入适量刚果红水溶液(1g/L)，静置5min，用自来水冲洗，可在菌落周围看到清晰的透明圈。测量诱变处理后菌株形成的透明圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)，与未经诱变处理的菌株的H/C值相比较，将H/C值增大10%以上的定义为正突变株，H/C值减小10%以上的定义为负突变株，而H/C值的改变量在±10%以内的为非突变株。按照公式(3)、(4)计算各诱变条件下的正、负突变率，正突变率最高的诱变剂量为最佳诱变剂量，并从最佳诱变剂量处理所得的突变株中，挑选出H/C值较大的菌株，接种于LB斜面，37℃培养12h后置于4℃冰箱内保存，用于进一步确定其β-甘露聚糖酶活力的大小。
（2）复筛：选取H/C值较大的的诱变菌株50mL种子液培养基，接种一环培养活化后，转接1mL到mL/mL发酵产酶培养基中，于37℃、r/min摇床培养，测定发酵液中的β-甘露聚糖酶活力。
2结果与分析
2.1紫外线诱变致死率的测定按照1.4.5的方法对出发菌株进行紫外线诱变处理，改变照射距离，恒定照射时间为10s，考察照射距离对出发菌株的诱变能力，以致死率在70%~80%的照射距离作为诱变剂量，结果见表1。
随着照射距离的延长，HDYM-04的致死率逐渐减小，当照射距离为20cm时，致死率接近%；当照射距离为60cm时，致死率最小，为53.8%±1.47%；当照射距离为50cm时，致死率为72.3%，所以将照射距离选定为50cm。在此基础上，改变照射时间为0、3、5、10、15、20s，对菌株HDYM-04进行紫外诱变处理，考察照射时间对出发菌株的诱变能力，以致死率在70%~80%的照射时间作为诱变剂量，结果见图1。
由图1可知，紫外线对菌株HDYM-04的致死效果十分明显，当照射时间为3s时，致死率就达到了63.7%±0.56%，随着处理时间的延长致死率逐渐增加，当照射时间为20s时，紫外线对出发菌株的致死率接近%，致死效果十分明显。由于照射时间为10s时，致死率为72.8%，所以选择紫外诱变的照射时间为10s。
2.2对菌株的诱变效应
在确定了紫外线对出发菌株HDYM-04的诱变剂量之后，利用1.4.6（1）的方法进行刚果红染色法初筛。利用平板上菌落的H/C值可以计算出紫外线诱变中菌株的正、负突变率及总突变率，结果如图2。
依据致死率所选用的最佳诱变剂量为照射距离50cm，照射时间为10s，此时，菌株的总突变率为76.11%，正突变率为54.60%，负突变率为20.92%。同时发现在这个最佳诱变剂量下，其诱变效果要优于其他诱变剂量，当照射时间从0s变化到20s时，最高正突变率出现在最佳诱变剂量处，所以这也间接证明，本实验选用的诱变剂量是合理的。
表2是第二轮紫外线诱变菌株的H/C值，这些菌株的H/C均较出发菌株有所提高，是诱变后的正变优良菌株，可以利用这些菌株进行摇瓶复筛。
表3是由初筛得到的优良正变菌株的摇瓶复筛结果。在初筛的13株菌株中，10株突变株的β-甘露聚糖酶活力比原始菌株HDYM-04有所提高，其中突变株U2-12的酶活力最高，达到了(±32.19)U/mL，较原始菌株提高了.19%。
2.3菌株U2-12遗传性状稳定性研究
为了考察菌株U2-12的产酶稳定性，将其连续传代培养7次，并测定每代摇瓶发酵液β-甘露聚糖酶酶活，结果见图3。可以看出，菌株U2-12经过7次传代后，其产生的β-甘露聚糖酶活力在1~U/mL之间波动，产酶能力没有明显改变，说明其遗传性状相对稳定，可作为进一步研究的对象。
3结论
本研究以实验室保藏的地衣芽孢杆菌HDYM-04为出发菌株，经过自然筛选、2轮紫外线诱变后，用刚果红染色法筛选β-甘露聚糖酶高产菌株，依据致死率所选用的最佳诱变剂量为照射距离50cm，照射时间为10s，此时，菌株的总突变率为76.11%，正突变率为54.60%，负突变率为20.92%，从50株突变菌株中筛得13株产酶能力较高的菌株，其中菌株U2-12的产酶能力最强，发酵液酶活达(±32.19)U/mL，为原始出发菌株地衣芽孢杆菌HDYM-04的.19%。实验结果表明，U2-12具有良好的遗传稳定性。
4讨论
紫外线诱变能够有效改变基因的稳定性，使诱变菌体的代谢能力较出发菌株差异显著。紫外线主要作用于胸腺嘧啶使其以环丁基环形成二聚体，形成胸腺嘧啶二聚体，RNA引物的合成将停止在二聚体处，DNA的合成也受阻，因而影响DNA的复制和转录，其作用结果是引起碱基转换、颠换、移码突变或碱基缺失。
综合实验结果分析，对于菌株地衣芽孢杆菌HDYM-04，紫外线诱变对其产β-甘露聚糖酶酶活影响较大，由此判断β-甘露聚糖酶基因的胸腺嘧啶对于紫外线诱变较为敏感。陈凤莲等[20]以黑曲霉A为出发菌株，采取2种方法对其进行诱变处理，与未经诱变的黑曲霉菌体相比，液体发酵后产木聚糖酶的最大酶活提高了89.19%。韩科芳[21]运用紫外-硫酸二乙酯-亚硝酸盐三重复合诱变菌株类芽孢杆菌属Paenibacillussp.CH-3，其发酵产酶酶活达可达近U/mL，较出发菌株产酶酶活提高了%。由此判断，紫外线对于芽孢杆菌属有较强的诱变能力，与本实验结论相符。
因此，紫外线诱变方法可以应用于地衣芽孢杆菌菌体的遗传改造，且获得β-甘露聚糖酶产量较高的优良菌株。目前对本试验获得地衣芽孢杆菌的进一步筛选及发酵条件的优化等工作仍在进行之中，进一步提高该菌株β-甘露聚糖酶的产量是今后努力的方向。
（来源：《中国农学通报》作者：周晓杭，杜春梅，葛菁萍）
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