文章标题：ToolkitforVisualizationoftheCellularStructureandOrganellesinAspergillusniger
发表期刊：ACSSyntheticBiology
影响因子：5.11
发表日期：年12月
1引言
黑曲霉是一种丝状真菌，广泛用于工业发酵蛋白表达和有机酸的生产，固有的生物合成能力（如分泌大量的生物分子），使黑曲霉成为一个有吸引力的生产宿主，但对其生产能力、细胞运输过程和分泌机制的分子成分的了解还不够。在本文中，介绍了一套标准化的工具，包括n端GFP肌动蛋白融合和色素蛋白的密码子优化，GFP肌动蛋白结构的表达有助于细胞骨架肌动蛋白丝的可视化，而色素蛋白结构的表型导致明显的红色。在这篇文献中构建了一套标准化的黑曲霉生物标志物，可用于研究形态、细胞间运输和分泌现象。
2简介
在黑曲霉中，分泌是在菌丝的顶端。Spitzenk?rper是组织中心，决定生长方向，是胞外囊泡的供应中心。相邻细胞之间的胞间运输通过隔膜进行，隔膜是一个动态调节的收缩环，允许营养物质和细胞器的流动。这个过程称为胞质过程，在细胞骨架中沿着肌动蛋白丝流动和发生。细胞器可视化方法是本研究的关键，引入了一个gfp-肌动蛋白融合蛋白来暴露肌动蛋白丝。然而，荧光蛋白(FPs)虽然广泛用于细胞定位研究，但并不适合同时显示多重细胞器，因为不同的FPs需要不同的激发和发射波长。此外，光谱重叠的出现使荧光蛋白的使用不切实际。
为了进一步加快对分泌和细胞器运输的研究，在这篇文献中作者制定了一种适合黑曲霉底盘的色素蛋白。色素蛋白来源于珊瑚，与GFP家族有关，进化出了独特的发色基团。与荧光蛋白不同，色素蛋白是肉眼可见的。它们经历了改变颜色的构象变化，从而消除了漂白和光谱的发生重叠，否则会导致信号交叉期间显微成像。这项工作的目的是建立一个研究细胞间运输和分泌系统的工具包，包括一个gfp-肌动蛋白融合和线粒体靶向色蛋白，可以显示细胞骨架和细胞器。
3图文解读
01
图1黑曲霉菌丝和GFP-肌动蛋白结构图
肌动蛋白丝可通过GFP标记的肌动蛋白被检测到。红色箭头表示可见的结构。在图的上部，肌动蛋白似乎包裹着一个细胞器。在B中，GFP标记的肌动蛋白包裹着一个液泡
荧光显微镜下可见GFP肌动蛋白被细胞器(图1A)，与以往细胞器与肌动蛋白共定位的研究一致。在一些隔区也可见(图1B)，尽管强度较低，肌动蛋白丝通过细胞质流促进营养物质和细胞器的运输，Spitzenk?rper不能被看到。可能是因为原生肌动蛋白基因仍然存在;只有一小部分的肌动蛋白被gfp标记。对未来研究的建议是降低天然肌动蛋白基因的表达，或用可调启动子控制的n端gfp-肌动蛋白结构取代它。
02
图2经MLS-ACOeforRed转化的黑曲霉菌丝在液体培养基中生长，与野生型菌株的菌丝相比，呈现出明显的红色。在转化的黑曲霉中存在MLS-ACOeforRed结构(预期尺寸bp)，通过PCR(lane1-3;凝胶图)。相反，在野生型黑曲霉中没有发现MLS-ACOeforRed结构(lane1?3;凝胶图)。阳性对照(5号泳道顶部)为含有MLS-ACOeforRed结构质粒(大小为bp)的PCR产物。
以一个线粒体定位序列(MLS-ACO)，转染后，与野生型菌株相比，最初的菌丝颜色没有变化。然而，当在液体培养基中生长时，与野生型相比，可以观察到明显的红色（图2)。只有在液体培养基中才能观察到红色的菌丝，这可能与特定培养条件引起的形态差异有关。对不同的色素蛋白进行更多的重复实验可能会揭示这种差异。后续的显微成像实验必须要做，以确定这些蛋白质是否真的有效地针对线粒体。
4总结
总之，研究表明，GFP-肌动蛋白和eforRed色素蛋白在黑曲霉中有表达。pkiA启动子和xlnD终止子已被证明可以与染色质编码基因结合并补充工具箱。
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