原创菌种前世今生之三菌种保藏有效期验

作者

雪然

编辑

兔兔子

来源

实验助手

一、菌种相关法规介绍

指导原则

实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、贮藏、确认试验以及销毁的记录，应有菌种管理的程序文件(从标准菌株到工作菌株），该程序包括：标准菌种的申购记录；从标准菌株到工作菌株操作及记录；菌种必须定期转种传代，并做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认，并记录；每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数；菌种生长的培养基和培养条件；菌种保藏的位置和条件；其他需要的程序。

指导原则

微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生:物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的重要环节。

16.4.2菌种处理、微生物鉴别和阳性对照室

菌种的处理包括的内容比较多，如菌种的传代、保藏、制备以及培养基促生长实验、阳性对照、微生物方法验证、消*剂和防腐剂的效力测定和对环境中分离菌的鉴别等，这些实验过程中都在处理活的微生物，处理不当会造成实验室环境污染，影响其他实验结果，因此，该室必须与其他实验室严格分开；必要时，应按实验室性质的需要保持对相邻实验室的相对压差；需采取必要的消*方式确保实验室洁净条件合格（如臭氧， 熏蒸等），以净化层流台作为局部级的控制措施， 是使用生物安全柜，所有的与活*菌种相关的活动都应在层流台或生物安全柜中进行。每次实验结束后要对层流台或生物安全柜及整个实验室环境进行消*。所有与菌种相关的试验废物均应经过灭菌处理后方可丢弃。

16.7菌种的管理

试验过程中，生物样本可能是最敏感的，因为他们的活性和特性依赖于合适的实验操作和储存条件。实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化，使尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。

药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或是用于标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。

标准菌株的复活或培养物的制备应按照供应商提供的说明或按已验证的方法进行。从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。标准储备菌株应进行纯度和特性确认。标准储备菌株可用于制备每月或每周1次转种的工作菌株。冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌株后，不得重新冷冻和再次使用。

6.4.1.2实验室必须保存有满足试验需要的标准菌种/菌株（标准培养物），除检测方法（如药物敏感试验、抗菌性能测试）中规定的菌种外，还应包括应用于培养基（试剂）验收/质量控制、方法确认/证实、阳性对照、阴性对照、人员培训考核和结果质量的保证等所需的菌株。

a）标准菌种必须从认可的菌种或标本收集途径获得。

b）实验室应有文件化的程序管理标准菌种（原始标准菌种、标准储备菌株和工作菌株），涵盖菌种申购、保管、领用、使用、传代、存储等诸方面，确保溯源性和稳定性。

是一本有代表性的、参考价值极高、比较全面系统的细菌分类手册。由美国布瑞德（Breed）等人主编。

《GBT-实验室质量控制规范食品微生物检测》

5.5.2.3.将标准菌株传代培养一次，制得标准储备菌株，应同时进行确认试验（纯度和生化检查）

7菌种保藏

7.1不同的微生物往往需要不同的保藏方法，以保证最理想的存活率、贮藏效果和纯度。从安全角度考虑和为了使菌种丢失的可能性降低到最小，无论何时，每个菌株至少需采用两种不同的方法保存。其中一种方法应该是冷冻干燥(冻干)或液氮贮藏(低温保藏)，这是减少遗传变异的 方法。在某些情况下(如细胞系)只能用冷冻的方法保藏，那么应将培养物放在两个各自独立供电线路的冰箱中或两个液氮罐中，保存双份

附录D低温冷冻保藏法

D.4.4.冷冻保藏：将含菌种的冻存管插入保藏塑料盒中置于-60~-80℃低温冰箱中保藏，保藏期间应定期检查活力及杂菌情况，保藏周期一般1~5年。

二、菌种保藏概念及解释

1、菌种保藏概念：运用物理、生物手段让菌种处于完全休眠状态，使在长时间储存后仍能保持菌种原有生物特性和生命力的菌种储存的措施

2、菌种保藏目的：通过菌种管保藏，使菌种达到不死亡、不变异、不污染，并且保留菌种性状（纯度、生化特征等）

3、菌种保藏方法：斜面保藏法、 管保藏法、磁珠保藏法

4、菌种保藏条件：低温、干燥、隔绝空气、低营养

三、菌种保藏有效期验证项目及依据

通过验证结果，证明菌种在一种保存方式对应的储存条件、管理流程的条件下，菌种在所保存的时间内没有发生死亡、污染和变异的前提下，菌种依然具有菌种保存前的特性

2.验证方案的频率的周期设置

2.1.验证次数设置

依照管理，验证一般进行三次（同时做三个批次独立平行试验）；

2.2.验证的频率

验证频次应该由长到短，一般像斜面和 管儿保藏法，目前已经应用广泛，其对应储存条件下的储存有效期，一般均有建议，实验室只要针对建议进行侧重于实验室内部管理流程的验证即可；而对于一些依赖于厂家耗材质量的菌种保藏方式，如磁珠菌种保藏法，验证的周期可参考厂家提供的相关资料进行，当然，提到厂家资料，不得不说，在这方面，一些国内产品提供的资料的确不敢恭维，建议查找多个厂家资料对比进行，在实验室方面尽量将验证作到尽量完整，验证频次一般越到验证周期的尾期时，频率尽量以周以内的频次进行。

2.3.验证周期

验证结束的周期应比需要验证周期更长，需要注重常规合理性，举个例子，铜绿假单胞菌斜面菌种应放置于常温保存，在进行验证时，需要







































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